感受态制备和电转化多种感受态.doc

一、金黄色葡萄球菌感受态制备1、平板上挑单菌落于TSB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。2、按1%接种于2ml:200ml 培养基培养2h，OD600=0.4-0.53、2个50ml管冰上预冷，4将培养的菌分装2个50ml管中，5000rpm离心6-8min，去上清。4、 加10ml 0.5M蔗糖，打散菌体，再加40ml 0.5M蔗糖混匀，5000rpm离心5min，去上清。5、 重复4 .6、 再重复4，但加到50ml 0.5M蔗糖后要在冰上冰浴30min，再5000rpm离心5min，去上清。7、 用600ul 0.5M蔗糖垂悬。8、 分装菌液，每管100ul。9、 液氮冷冻10s，存于-80。2、 大肠杆菌感受态1、平板上挑单菌落于LB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。2、按1%接种于2ml:200ml LB培养液体基培养2h（用50ml管），到OD600=0.4-0.6。3、冰浴10min。4、4 5000rpm离心5min，去上清。5、 加30ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。6、 2 ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。7、 分装每管100ul，存于-80。3、 超级感受态（1） 溶液1、TB （1L） 终浓度MnCl2-4H20 10.88g 55mmol/lCaCl2 1.665g 15mmol/lKCl 18.65g 250mmol/lPIPES(0.5mol/l,ph 6.7) 20ml 10mmol/lH2O 补至1L0.45um 过滤除菌1、 PIPES(0.5mol/l,ph 6.7),哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES),99.5% 英文名称：Piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid 1.5g PIPES溶于80ml水，5mol/l，KOH调Ph=6.7，定容100ml。0.45um 过滤除菌，-20保存。2、 SOB培养基 1L胰蛋白胨 20g酵母浸粉 5gNaCl 0.5g摇动容器使溶质完全溶解。加10ml 250mmolL KCl溶液(将1.86g KCl用100ml去离子水溶解即配成250mmol/l KCl溶液)。用5mol/L NaOH 调pH值至7.0。用去离子水定容至1L。在15 psi(1.05kgcm2)高压下蒸汽灭菌20min。该溶液在使用前，加入5ml灭菌的2 mol/l MgCl22molL MgCl2溶液的配制方法如下：用90ml去离子水溶解19g MgCl2，用去离子水调整体积为100ml，在15psi(1.05kgcm2)高压下蒸汽灭菌20min。(二)、Protocol:1、挑单菌落接种250ml锥形瓶中，25ml LB或SOB培养基37, 培养6-8h.2、取三个1L锥形瓶，均加入250ml SOB培养液的，分别加入2ml、4ml、10ml菌液,37, 培养过夜.3、次日早上，测3瓶菌液0D600, 45min 测一次。4、当有一瓶菌液0D600=0.55, 将该瓶之于冰上10分，其余弃掉。5、4 3900rpm 离心10min, 收集菌体。6、 弃掉培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干剩余液体。用真空吸尘器将贴附于壁上的培养基吸干。7、 加80ml 预冷的TB重悬细菌沉淀, 轻轻旋转, 勿用涡旋或枪头吸打。8、 4 3900rpm 离心10min, 收集菌体。9、 弃掉培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干剩余液体。用真空吸尘器将贴附于壁上的培养基吸干。10、 20ml 预冷的TB重悬细菌沉淀, 轻轻旋转, 勿用涡旋或枪头吸打。11、 加1.5ml DMSO （DMSO是二甲基亚砜,是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。）终浓度7%, 轻轻旋转, 勿用涡旋或枪头吸打, 冰上静置10min。12、 快速将悬液分装到冷却的无菌离心管，封紧管口，液氮速冻，存于-70。4、 电转化（一）、电转化感受态细胞的制备1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）2.37，220rpm，培养14-16个小时。3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4，2500rpm离心10分钟。5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4，4000rpm离心10分钟。6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4，离心10min。7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4, 4000rpm, 离心10min。8.弃上清，每个离心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 冰箱中保存。同时取100 l感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。9. 次日观察转化子生长情况，并记录。（二）、连接产物纯化1将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂:10l of ddH2O2l of 3M NaAC（PH5.2）50l of 无水乙醇轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20放置1小时以上；2.4，top Speed 离心30分钟；3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；4.加入500l70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；5.4，top Speed离心5分钟；6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味；7.加入10lddH2O重新溶解沉淀，4短期保存，-20长期保存备用；（三）、电转化1.从-80冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2.取1 l 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。3.将40100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。4.打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。5.将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；6.将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000l的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。737，220250rpm复苏1小时。8. 取20l转化产物加160lSOC涂板，放于37温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30%的甘油后混匀80保存。注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80l ，SOC 80l，IPTG 20 l。（四）、电击杯清洗流程1.用清水将电击杯稍冲一下。2.向电击