分类学原理与中药指纹图谱的研究.doc

分类学原理与中药指纹图谱的研究-1(2010-12-31 13:34:10) 转载标签： 杂谈分类： 中药材标准与检验 分类学原理与中药指纹图谱的研究 近20年来，将已知的内在化学成分及其测定方法用于质量控制，制定相应质量标准取得很大进展，药典收载含量测定的品种越来越多。把已知的主要成分或有药效的成分作为指标予以检测控制，比之过去是很大的突破与进步。但是从中医药的观点看，指标成分的控制，难以真正控制中药功效。麻黄素与麻黄、人参皂甙与人参等在中医来看是两回事。传统中医药理论和实践对中药质量评价模式提出了新的要求，一种综合的多指标评价中药质量模式，中药应运而生。1 指纹图谱的概念“指纹”（fingerprint）作为鉴定，起源于19世纪末20世纪初犯罪学和法医学。人的指纹具有唯一性的特点，即每个人的指纹是不一样的，是有特征的，这种特征并不随时间环境的变化而改变。因此，指纹图谱被广泛应用于罪犯的识别，特殊证件的制作等领域。在中药的分析和研究过程中发现，中药是多种化学成分的混合体，其药效是多种活性组份共同的作用。因此单一活性组份的测定和评价不能说明中药质量的好坏。因此将指纹这一概念引入中药分析，在这里，指纹这一内涵已发生变化，它不象犯罪学中的指纹强调的是个体的“绝对唯一性”，也不是DNA指纹中那种内在的遗传学特性，而是用一定的方法（如HPLC，GC，TLC，UV等），对特定的对象（如中药材，提取物，注射液等），得到有特征性的相对稳定的图谱，把它作为鉴别和质量控制的参照依据。2 中药指纹图谱研究现状简介2.1 薄层色谱(TLC)指纹图谱TLC具有快速、经济、操作简单、适用范围广等优点，在国内外广为使用。用固定波长对薄层展开的各斑点作薄层扫描的扫描图谱比目测的层析图谱更为客观准确，因而具有更好的指纹鉴别意义。林明美等对柴胡 10 个种近 40个样品进行了薄层指纹分析。结果发现，凡药材来源、外形区别显著者，其指纹图谱差异也显著，因此可根据图谱去推断药材的物种。苏薇薇等对10个不同产地的黄芩样品，将乙醇、乙酸乙酯、乙醚提取液分别进行了聚酰胺薄膜分析，从中提取能反映样品间差异的数量化特征，用聚类分析方法对黄芩进行鉴别分类，结果准确。2.2 高效液相色谱 (HPLC) 指纹图谱HPLC 由于具有分离效能高、分析速度快等优点，近期已广为普及用于中药的定量分析。乔延江等测定了不同种类、不同产地的62个蟾酥样品的HPLC图谱，从16个色谱峰中选取9个有代表性的色谱峰，应用三层反向传播 (BP) 人工神经网络方法进行特征提取，可直接进行化学模式识别。粟晓黎等以鬼臼所含毒性成分为分析对象，利用HPLC建立了一个快速鉴别鬼臼、龙胆、威灵仙的指纹图谱分析方法，结果表明鬼臼指纹图谱与威灵仙、龙胆截然不同，该法不仅可鉴别鬼臼与威灵仙、龙胆，而且可用于不同来源的鬼臼的鉴别。2.3 气相色谱 (GC) 指纹图谱GC 具有高效、高选择性、用量少和分析速度快等优点。凌大奎等测定了 6 种常用中药砂仁、当归、苍术等的挥发油成分的 GC 保留指数 (GCRI)，从中选择若干代表性成分的GCRI 值组成各自的 GCRIs 谱，3 个实验室所测保留指数的 RSD1.0%，且聚类分析结果与传统鉴定结论相似。苏薇对45 个细辛样品进行了 GC-MS 分析，并从样品挥发油组分总离子流图中获取不同种细辛样品化学本质差异的数量化分类特征，经过 PRIMA 法处理，实现了计算机对 3 种细辛的鉴别分类，结果与实际相符。 其它还有：高效毛细管电泳 (HPCE) 指纹图谱；紫外光谱 (UV) 指纹图谱；红外光谱 (IR) 指纹图谱；核磁共振 (NMR) 指纹图谱；质谱 (MS) 指纹图谱；X-射线衍射指纹图谱；DNA 指纹图谱等用于中药的研究。3 数值分类学简介数值分类学是用数量的方法来评价有机体类群间的相似性，并根据相似性值将某些类群归成更高阶层的分类群。数值分类学是利用有机体大量指标（包括形态学的、细胞学的和化学的等各种指标）、数据，按一定的数学模型，应用电子计算机运算得出结果，从而作出有机体的定量比较。它不仅运用的指标数量多，运算速度快，而且没有偏见，比较客观，这是以往分类学家难以做到的。下面简略介绍数值分类学的基本步骤。（一）确定研究对象进行数值分类工作的第一步，是要确定研究的单位，它可以是个体、物种、属等单位，但主要是应当使被挑选出的单位尽可能代表所研究的有机体。（二）选择指标只有通过比较分类单位之间特征的相似程度，才能确定这些分类单位是否相似，因此分类单位确定后，就要选择指标。指标的选择对数量分类学的分类工作至关重要。就各种研究对象的分类而言，要选择相对稳定的指标，也就是要选择那些受环境影响较小，保守性强的指标。除形态、解剖特征外，也可选择化学的、DNA的等多种多样的指标。使用的指标越多越好（三）指标的编码指标选出后，为了下一步进行数学运算，必须以数来表示，因而必须对各种指标进行编码。不同的指标有不同的编码方法，简述如下：1.数值指标 用自然数和实数所表示的指标均称为数值指标。例如生物形态的各种长度、面积、体积、重量等；各种指标之间的比例关系；各种仪器测试得到的数据等。数值指标本身就已经是数值，可直接进行数学运算。2.二元指标 指标表现为两种对立状态者，称为二元指标。例如植物的心皮是分离或是结合、薄层色谱中斑点的有无等，即非此即彼的指标。它的编码很简单，将2个指标分别以“1”和“0”表示。“1”为肯定的状态，“0”为否定的状态。3.有序多态指标 表现为两种状态以上，能排列在一定次序上的指标称为有序多态指标。例如植物体表被微毛、有毛、多毛、密毛。编码时可以取连续排列的非负整数0、1、2、3n，分别表示n+1个有序多态指标的状态。例如具毛的指标可编码为：无毛(0)，具微毛(1)，具毛(2)，多毛(3)，密毛(4)。4.无序多态指标 表现在3个状态以上没有次序的指标称为无序多态指标。例如花序有穗状、总状、圆锥、伞形、头状等。编码方法通常是将无序多态指标分解为互相独立的二元指标，如穗状花序、非穗状花序；伞形花序、非伞形花序等。（四）原始数据的变换和标准化从研究对象的各方面观察记录的指标数据多种多样，有来自形态解剖的、化学的、分子生物学的等等。来源各不相同，数据本身所代表的意义也不同，度量标准亦异。指标之间的这种差异将影响分类运算的结果。因此，在进行运算之前需要先对数据进行变换或标准化处理。目前在分类运算中，有一种数据变换已成为常规手段，叫作数据标准化。尤其在主成分分析和许多相似性系数的运算中，原始数据的标准化已成为必不可少的步骤。（五）相似性概念的数量化相似性程度用数值来表示称为相似性系数。相似性系数的出现是生物分类朝定量方向发展的重要标志。相似性系数有距离系数、相关系数、联合系数、信息系数和模糊系数5个主要类型。现将应用较多的2种简述如下。1.距离系数 在数值分类学中，距离系数应用较早。其优点是对于分类运算有较好的稳定性，而且也比较直观，所以直至今天仍被普遍采用。常用的距离系数计算公式有：欧氏距离系数：此外，还有重量欧氏距离、标准欧氏距离、Minkowski距离系数、马哈那罗比（Mahalanobis）的距离等等。2.相关系数 相关系数来自统计学中的相关系数。它在数值分类学中颇为重要。相关系数值的变化范围在-11之间。用它来表示相似性程度，其数值变化与距离系数有着相反的意义。相关系数值越大，相似性程度也越大，反之，值越小，相似性程度也越小。相关系数计算公式如下：当2个样品之间的R=1时，为完全正相关；当R=0时，两个样品的数据为完全不相关；当R=-1时，则为完全负相关。夹角余弦法 也是相似系数的一种，夹角余弦法的计算公式如下：夹角余弦=xiyi/( (xi)2)1/2( (yi)2)1/2夹角余弦法的计算结果在-11之间。当2个样品之间的R=1时，为完全正相关；当R=0时，两个样品的数据为完全不相关；当R=-1时，则为完全负相关。总的说来，虽然相关系数法与夹角余弦法这两个公式计算所得结果存在差别，但所得结果的趋势完全一样，两种方法不存在本质差异，只是程度不同而已。值得指出的是，相关系数法主要反映两矢量间的变化趋势并可减少背景量值的影响；而夹角余弦法则主要反映两矢量间的夹角余弦值，表现了两矢量间的形状差异。在中药指纹图谱研究中，相关系数与夹角余弦2种方法应用较广。（六）分类运算从原始数据开始，经过很多步骤，算出了分类单位之间的相似性系数矩阵，就要开始着手聚类运算。聚类运算方法是整个分类分析的核心内容，选用策略不同，结果也将不同。按距离系数聚类是一种聚合的分类方法，运算过程大致如下：从类群的相似性距离矩阵中找到距离最小的1对类群，将这两个类群合并得到1个新的类群。然后计算新类群与其余所有类群之间的距离系数，并以此新类群代替被