脑缺血再灌注后神经元凋亡及缺血预适应的机制探讨.doc

缺血预适应抗脑缺血再灌注后神经元凋亡的机制( 文献综述 )专业：生理学姓名：董印 （9917028）班级：99级临床医学七年制专业导 师：陈连璧教授（山东大学医学院生理学研究所）2004年6月16日缺血预适应抗脑缺血再灌注后神经元凋亡的机制( 文献综述 )缺血性脑中风是目前严重威胁人类健康的疾病之一，其发病率及致死率均非常高。尽管近十几年来对脑缺血机制进行了大量研究，但因其机制极为复杂，缺乏有效的干预手段，故预后极差。动物实验研究发现，脑缺血后及时地恢复血流灌注可以逆转缺血半影区的神经元死亡，但在某些易损区却可以诱发迟发性神经元凋亡。脑缺血再灌注后神经元凋亡，是一个复杂的过程，阻止凋亡的发展，将为脑血管病的治疗提供更为准确的理论支持。近年来研究证明，短暂的非致死性缺血及随后的氧化应激启动细胞内信号转导通路，可通过调节靶蛋白活性，特别是促进转录因子如HIF-1、AP-1、NF-B、P53等的表达或提高其转录活性，从而合成多种对细胞有保护作用的应激蛋白质，保护细胞免受损伤或修复已有损伤，即所谓缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC）。本文对缺血预适应抗凋亡的机制作以综述，以期对探讨脑缺血再灌注后神经元凋亡的干预措施有所帮助。. 脑缺血再灌注导致神经元凋亡1.1 脑缺血再灌注损伤缺血再灌注损伤是指组织器官缺血一定时间重新得到血液灌注时，其功能不仅未能恢复，结构损伤和功能障碍反而加重的现象。动物实验证明，这种迟发的神经元死亡包括坏死和凋亡两种形式。近10余年来，人们对脑缺血再灌注损伤进行了广泛、深入研究，提出“缺血损伤瀑布”的概念，但其机制仍未能完全阐明。目前的研究认为，缺血后神经元的凋亡发生是一个多环节调控过程，其中包括基因表达的改变、兴奋性氨基酸的释放、钙离子稳态失衡、蛋白合成受抑、热休克蛋白表达受阻、脂肪酸与自由基形成、蛋白酶激活等过程，但凋亡机制仍无定论。细胞凋亡是Kerr等人在1972年提出的，它是一种由基因控制的细胞自主性死亡过程，在生理情况下也称“程序性细胞死亡”，是维持内环境稳定的机制之一1。近年来发现细胞凋亡与某些病理状况有关，过度抑制或过度增强均可导致疾病的产生。越来越多的证据表明，神经元凋亡是脑缺血再灌注后迟发性神经元死亡的基本形式，但在耐受细胞中同时发现一种平行的主动神经元存活过程，这两种相反的级联过程均由基因调控2。有关的基因介绍如下。1.2 凋亡相关基因1.2.1 bcl-2家族 Bcl-2是相对分子量为25KD的整和膜蛋白，分布于线粒体、内质网和细胞核膜上。其羧基端含疏水序列，与其分布于线粒体膜有关，而其氨基端主要分布于细胞质内。最近研究显示bcl-2家族在脑缺血动物模型梗死灶边缘表达增高，不同成员在凋亡过程中对线粒体作用不同，其中bcl-2、bcl-xl、bcl-w、mcl-1等对线粒体有保护作用，1而bax、bad、bak、bik、bid、bim、bok及bcl-x等则有促凋亡作用，细胞凋亡与否，取决于这两种蛋白的比值4，5，6。该族蛋白的功能通常以二聚体的形式所决定，当以Bcl-2同源二聚体存在时，发挥抑制细胞凋亡的功能，而当Bcl-2与Bax或Bid等形成异源二聚体时，抑制凋亡作用丧失，从而促进凋亡的发生。1.2.2 p53 野生型p53基因具有诱导细胞凋亡的功能7，但该基因突变后可抑制凋亡。野生型p53基因编码的P53蛋白是一种DNA结合蛋白，在细胞周期的G1期发挥检查点的功能，负责检查染色体DNA是否损伤。如有发现有缺陷的DNA，就可刺激CIP(细胞周期蛋白依赖激酶CDK-interacting protein-1)的表达，阻止细胞进入细胞周期，并启动DNA修复机制。一旦修复失败，P53则启动细胞凋亡机制。研究发现P53介导凋亡的机制不需要P21的参与，主要是通过上调bcl-2家族的促凋亡成员bax及下调抗凋亡成员bcl-2和bcl-xL。Bax促进cytC的释放，通过与Caspase-9结合而激活死亡执行者Caspase-3，导致细胞凋亡。1.2.3 Caspase Caspase家族蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶，能在Asp之后切割蛋白，迄今已发现十余种Caspase。脑缺血后，氧化应激、持续性去极化均损伤线粒体通透转换孔（MPT），使线粒体通透性破坏，导致Cyt C及凋亡诱导因子AIF释放，从而启动调往信号途径。Cyt C从线粒体释放到细胞浆后与凋亡蛋白酶激活因子Apaf- 1结合，激活Caspase-9，Caspase-9切割后激活Caspase-3，后者被认为是凋亡的最终执行蛋白。AIF从线粒体释放到细胞浆后进入核内，失去其线立体定位序列结构域，表达凋亡效应。实验表明，Bax可从细胞浆转移到线粒体，增加线粒体膜的通透性，释放Cyt C入细胞浆，激活Caspase-313。1.2.4 fas/apo-1 Fas是一种细胞表面受体，它伸向细胞浆的部分有一段与TNF受体相似，与TNF和神经生长因子（NGF）受体高度同源。FasL蛋白与Fas分子结合，通过信号转导，最终诱发凋亡8。1.2.5 ICE基因家族这是最近克隆出的一个哺乳动物的凋亡基因家族，与线虫的ced-3有一定同源性，编码丝氨酸蛋白水解酶，可使IL-1前体激活。该基因导入小鼠神经元可引起凋亡，且这一作用可被bcl-2阻断。1.2.6 其他 crmA、H-ras、TGF-1、RP-2、HSP等都与神经元凋亡有关。缺血后神经元凋亡与死亡决定簇相关受体（Fas和TNF-R）的表达和活化以及P53介导的促凋亡性Bcl-2家族蛋白Bax的上调密切相关。神经元Fas或TNF-R的表达与Fas配体和TNF分泌增加共同激活死亡受体信号，通过凋亡蛋白酶Caspase-8的活化、线粒体膜通透性转运孔（MPT）以及效应性凋亡蛋白酶的活化促进凋亡3。DNA损伤可激活两种调节p53的激酶，共济失调毛细管扩张空变激酶（ATM）和DNA依赖性蛋白激酶（DNAPK）。ATM磷酸化p53，DNA-PK磷酸化p53抑制蛋白mdm-2，p53活化后转移至胞核，起转录因子作用，诱导凋亡效应基因如Bax表达。缺血后神经元内已发现Bax信使和蛋白表达增加，超过抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x1， 形成Bax同源二聚体，并与线粒体外膜结合形成MPT。这导致CytC释放和凋亡执行瀑布的活化。1.3 凋亡的其他机制1.3.1钙超载 正常生理状态时，细胞外钙离子浓度为细胞内的10000倍，细胞通过钙泵或Na+/Ca2+交换系统，将钙离子排出细胞。脑缺血再灌注时，钙泵功能减弱，同时线粒体、内质网贮留钙作用降低，钙释放增多，引起细胞内钙超载。细胞钙稳态失衡在缺血性神经元凋亡的发生中起关键作用，是导致神经元凋亡的“最后共同通路”9。钙超载通过激活某些钙离子依赖性蛋白酶10，引起一系列生物化学和代谢变化的连锁反应，形成凋亡小体。钙超载引起神经元凋亡主要途径是：引起线粒体内钙超载，影响其氧化磷酸化的功能，导致ATP产生减少；激活一些破坏性的Ca2+依赖性的蛋白酶，如溶酶体中的中性蛋白酶、胞膜的磷脂酶A和核酸内切酶等，引起细胞结构的破坏；诱发脑血管痉挛，通透性增加，引起进一步缺血和脑水肿形成；突触前、后膜蛋白质磷酸化，导致进一步Ca2+超载10。1.3.2 兴奋性氨基酸和氧自由基兴奋性氨基酸系指中枢神经系统中兴奋性突触的主要神经递质，主要包括谷氨酸和天门冬氨酸。当缺血再灌注时，突触前谷氨酸等释放增多和/或再摄取减少，导致突触后兴奋性氨基酸受体的过度刺激11。当谷氨酸与其受体-氨基羟甲基恶丙酸、N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）结合后，促使钠和氯离子以及水的内流，导致神经元急性肿胀。同时NMDA调控的钙通道开放，细胞外钙离子大量内流，细胞内钙超载，激活多种蛋白酶。蛋白水解酶可以降解细胞骨架，磷脂酶可以产生氧自由基12，激活一氧化氮合酶生成一氧化氮，造成细胞膜和线粒体损伤，最终导致细胞膜破坏及神经元损伤，诱导细胞凋亡。再灌流后，由于供氧得到改善，提供了生成自由基的原料，而血液中清除自由基的物质尚未生成，致使自由基呈爆发性增加。自由基与细胞膜上的酶、受体及其它成分结合，影响细胞膜的结构、功能和抗原特异性，加以不饱和脂肪酸的过氧化产物丙二醛可使细胞膜的空隙扩大，通透性增加，导致细胞进一步损伤，加重脑水肿、颅高压。2. 缺血预适应对缺血神经元损伤的保护作用2.1 缺血预适应的概念 缺血预适应是指某一组织一次或多次短暂非致死性缺血再灌注后，该组织对以后较长时间的致死性缺血损伤产生显著的耐受性，表现为实质组织细胞死亡明显减少，梗死范围大幅度缩小，器官功能障碍明显减轻等14。2.2 动物模型的建立常采用沙鼠或大鼠，以10%水合氯醛（0.35ml/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上。作颈前皮肤正中切口，暴露双侧颈总动脉，首先阻断其全脑血流1-3分钟，造成全脑缺血，然后恢复脑血流灌注，数日后再次阻断脑血流8分钟或更长时间，造成致死性缺血，观察缺血预适应对后继长时间缺血损伤的影响。2.3 常用实验指标2.3.1 生理学方法 记录血压、心电的变化，观察缺血预适应动物模型的血压、心率等指标及其改变，与单纯脑缺血动物进行区别。2.3.2 病理学检查 实验动物断头处死检查后，取其脑在脑前极与视交叉连线中点、视交叉、漏斗柄、漏斗柄与脑叶尾极之间分别作冠状切面。5片脑组织置于2%的氯化三苯基四氮唑（TTC，PBS溶解）溶液，370C恒温避光温育30min。正常脑组织为红色，梗死处为白色。用图象分析仪可测定梗死面积占总脑片面积的百分比。光镜下主要观察神经元变性、坏死和胶质细胞反应。2.3.3 形态学观察：电镜下观察神经元形态学改变。凋亡初期，可见到微绒毛消失，神经元表面光滑，染色体浓集，细胞质浓缩，细胞体积缩小内质网膨胀；中期可见到浓缩的细胞核片段化，细胞表面成泡状，凋亡小体形成；后期凋亡小体被临近的活细胞吞噬。 2.3.4. DNA降解分析：新鲜脑标本细胞裂解，先用酸或氯仿抽提DNA，再用乙醇沉淀。在明胶板上电泳后，用溴化乙锭（EB）染色，可出现经典的DNA梯形电泳条带（DNA Ladder）。2.3.5 流式细胞仪检测：利用碘化丙锭（PI）与钙依赖性磷脂结合蛋白（Annexin V）进行染色，一般活细胞对PI拒染，染上时即提示凋亡已进入到较后期，Annexin V极易与磷脂酰丝氨酸（PS）结合，而PS在凋亡早期即从细胞膜内转移到细胞膜外，故可用Annexin V来充当探针。2.3.6 3-OH原位末端标记法（TUNEL法）：用末端转移酶（TDT）将标记的脱氧核苷酸（dUTP）转移到DNA的断裂末端3-OH上，标记物可为地高辛、生物素（间接法）或各种荧光素（直接法）等。然后，在显微镜下或用流式细胞仪记数阳性染色的细胞百分数用于检测细胞凋亡情况。2.3.7 其他指标，如凋亡相关细胞因子或蛋白的检测、免疫组织化学及蛋白免疫印迹分析等2.4 脑缺血预适应保护缺血神经元的机制缺血及随后的氧化应激启动细胞内信号转导通路，通过调节靶蛋白活性，特别是促进转录因子如HIF-1、AP-1、NF-B、P53等的表达或提高其转录活性15 16，从而合成多种对细胞有保护作用的应激蛋白质，保护细胞免受损伤或修复已有损伤。体外研究表明缺血预适应动物模型脑内有新的mRNA及蛋白质合成。亚致死性缺血（大鼠颈动脉夹闭2min）可使脑对其后的缺血（从缺血后24h持续25d）发生耐受。这一耐受窗与新基因表达时程一致，并与即早基因（c-fos、c-jun、jun-B、jun-D）、热休克蛋白、抗氧化酶（MnSOD、水解酶、谷胱甘肽过氧化物酶）和MPT抑制剂（Bcl-2、Bc1-x1）上调有关。脑缺血预适应保护缺血神经元的主要机制如下。2.4.1凋亡抑制基因bcl2和bcl-xl表达上调Krajewski用心脏停搏造成脑缺血10min，在一些缺血敏感区如CA1区bcl-2呈低表达，而bax大量表达。缺血后0 53h内，许多脑区Bax大量增多，形态学上出现神经元退化。在短暂缺血早期Bcl-2蛋白在神经元亚群中有稳定表达，但从3h后，形态学上发生退化的神经元均出现Bcl-2下降，说明bcl-2基因在神经元缺血敏感性上起十分重要的作用。用中药脑宁康干扰后发现，各时相Bcl-2表达均有所增强，Bax表达均明显减弱。病理切片显示，3min的缺血预处理几乎起不到任何保护作用。Wistar大鼠经脑缺血预适应处理后，各时相海马CA1区神经元Bcl-2表达均增强，而bax表达均减弱，提示凋亡相关基因在脑缺血预适应中起一定的作用17。我们实验室的研究发现，脑缺血预适应可上调bc-l和bcl-xl表达，抑制bax表达23。同时，还通过下调p53的表达，抑制 caspase-3的作用和bcl2的表达及其作用。2.4.2 caspase-3的抑制 zVAD-fmk、选择性的caspase-3抑制剂zDEVD-fmk和选择性caspase-1抑制剂YVAD-cmk都能减轻大脑中动脉闭塞(MCAO)后的组织损伤，非特异性的非肽类半胱天冬酶抑制剂由于能通过血脑屏障及进入神经元与胶质细胞，将是新的治疗中风和其他脑损伤的途径。半胱天冬酶抑制剂的治疗窗远大于Glu受体拮抗剂，在中度缺血后再灌9h，zDEVD-fmk仍有保护作用，而MK-801只在损伤后1h内有效，二者的合用将进一步减少缺血后损伤，并协同扩展治疗窗。凋亡过程需新蛋白的合成，使用蛋白合成抑制剂如环己酰亚胺可减少MCAO后的梗塞体积，同时使用NMDA受体拮抗剂和环己酰亚胺以阻断缺血坏死和凋亡使局灶性缺血大鼠的梗塞体积进一步缩小。 2.4.3 HSP70表达增强 脑缺血可使神经元内蛋白变性，变性蛋白与HSP70结合从而使HSF活化，活化的HSF转位到核内，启动HSP70的转录18。HSP70起分子伴侣的作用，与胞浆蛋白质结合并辅助其折叠运榆和装配。缺血预适应诱导神经元产生HSP-70，具有神经保护作用，应用病毒载体使大鼠HSP70过度表达可改善脑缺血后神经元存活率19。2.4.4 p53表达表达下调P53作为转录调节因子直接下调bcl-2基因的表达，在转录水平激活bax的表达，局灶脑缺血、脑外伤后脑内p53基因的转录活性上调，表达增加，而p53缺失动物（p53-/-）在脑缺血中表现出神经元保护作用，提示p53在脑缺血再灌注神经元凋亡其作用20。Tomasevic等21在研究IPC中 p53的作用时发现，亚致死量和致死量缺血均可诱导p53表达，缺血易损区和耐受区均有p53表达，但IPC组较非IPC组p53水平低。Crumine等22研究局灶脑缺血时发现，转基因小鼠（p53+/-）较基因敲除纯合子小鼠（p53-/-）脑损伤轻，认为p53水平与缺血预后相关。较高水平促进凋亡，较低水平抑制凋亡。2.4.5 其它。即早基因、白介素等对缺血再灌注后神经元凋亡的作用也有报道。 小结脑细胞在缺血过程中，凋亡与抗凋亡的过程相互联系，相互制约，如何利用其抗凋亡机制，减少细胞凋亡的发生，对脑缺血病人的治疗及预后至关重要。脑缺血预适应现象发现后，研究人员制作了多种脑缺血预适应动物模型，结合细胞培养和脑薄片技术，研究了BIP中的某些介质、受体、基因及蛋白的变化，但其详细机制仍有待于进一步研究。如能对脑缺血预适应过程中产生的某些物质进行分离、纯化，试用于卒中的治疗，也许将提高脑神经元对缺血的耐受性，延长治疗时间窗，减轻后遗症，并为脑损伤等疾病的防治提供新的选择，为开发神经元保护药物提供新的思路，也为开展缺血性脑血管疾病的基因治疗创造条件。参考文献1. Kerr J. F., Wyllie A.H. Currie AR. Br. J. Cancer,1972 (26):2392. Dawson T M, Dawson V L, protection of brain from ischemia, cerebrovascular disease 1997,349-3523. Budd S L, mechenism of neuronal damage in brain hypoxia: focus on the role of mitochondrial calcium accumulation Pharmacol Ther,1998,80(2):203-2294. 兰虹，脑缺血神经元凋亡的研究,中华医药杂志，2003，3（10）5. Asahi M, Hoshimaru M, Uermura Y, et al. J cereb Blood Flow Metab,1997,17(1)6. Tsujimoto Y, Shimizu S, Bcl-2 family:life-or-death switch. FEBS Lett 2000;466(1):17225-172287. 高天明，刘红梅，佟振清，脑缺血再灌注后P53和P21在海马CA1区的选择性表达，细胞调控的探索，军事医学科学出版社，1999:253-2578. Kiessling M, Gass P,Brain Pathol,1994;4(1);77-839. Matsude T, Arakawa N, Takuma K, et al.SEA0400, a novel and selective inhibitor of the Na+ -Ca2+exchanger, attenuates reperfusion injury in the vitro and in vivo cerebral ischemic models. J Pharmacol Exp Ther 2001;298(1):249-25610. Dugan LL, Sensi SL, Canzoniero CMT, et al. Mitochondrial producation of reactive oxygen species in cortical neurons following exposure to N-methyl -D-asparate J.Neurochem, 1995,15(10):946-95911. Dimagl U, Iadecola C et al. Pathobiology of ischemic stroke: an integrated view. Trends nuerosci,1999,22(9):391-39712. Lewen A, Matz P, Chan PH. Free radical pathways in CNS injury. J Neurotrauma, 2000,17(10):871-89013. 大鼠脑缺血预适应对脑线粒体功能的影响，基础医学与临床，2003，23（3）：292-29514. Purcell, Jeanette E.et al, Strain-dependent response to cerebral ischemic preconditioning: differences between spontaneously hypertensive and stroke prone spontaneously hypertensive rats.N euroscience Letters;2003,339( 2): 151-15515. 大鼠脑缺血后APE/Ref1蛋白表达对神经元凋亡的影响，福建医科大学学报，2003，37（1）：32-3716. 脑缺血再灌注损伤时的表达和细胞凋亡，卒中与神经疾病，2003，