紫外分光光度法测定灵芝孢子粉多糖实验报告.doc

紫外分光光度法测定灵芝孢子粉多糖含量的方案实验参与人员：实验进行的时间：一 实验目的建立灵芝孢子粉多糖的含量测定的方法。二 操作步骤1 对照品溶液的配制：取无水葡萄糖约10mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，加甲醇定容，制得对照品贮备溶液。药材取样量（mg）稀释的体积（mL）浓度（mg/mL）无水葡萄糖10.0001101.00002 测定波长的选择：加显色剂的空白溶液：精密称取苯酚约0.5g，用100ml蒸馏水定容。对照品溶液：密量取对照品溶液0.5ml于10ml刻度试管中，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min即的。测定：在可见光区200700nm内对三份溶液进行扫描，确定显色剂是否影响吸光度，确定对照品溶液的最大吸收波长。照紫外-可见分光光度法（2010版药典附录V A ）测定,待测定对照品溶液的吸收光谱中显示，无水葡萄糖在与苯酚、浓硫酸显色后，在480-510nm处有明显紫外吸收，max=492nm，故确定测定紫外吸收的测定波长为492nm。全波长扫描结果见图1。图1：空白、显色剂、无水葡萄糖对照品溶液显色后的全波长扫描光谱3 供试品溶液的制备方法考察取灵芝孢子粉粉末（过四号筛）0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加水90ml，加入回流3h，放冷，摇匀，精密量取50ml，加入乙醇150ml，摇匀，4放置12h，取出，离心，倾去上清液，沉淀加水溶解并转移至150ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，为供试品溶液。4 标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液0.10ml，0.15ml，0.20ml，0.25ml，0.3ml分别置于试管中，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，以蒸馏水为空白对照，在最大吸收波长处测定各溶液吸光度。以对照品质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。表1 标准曲线结果样品编号取用量（mL）吸光度11.00.205421.50.407932.00.617842.50.823753.00.98785 方法学考察 5.1精密度试验取标准曲线项下1.5mL无水葡萄糖对照品溶液制备的样品，在最大吸收波长处连续测定吸光度6次，求出RSD。表2 精密度考察样品编号吸光度A平均吸光度ASDRSD%10.40970.4018 0.00571.42 20.405630.401140.398350.393360.40265.2稳定性试验取药材0.5g，精密称定，按供试品制备方法制备溶液，精密量取该供试品溶液0.5ml，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，在反应后10min，15min，25min，35min，45min，60min，在最大吸收波长下测定吸光度,求RSD值。表3 稳定性考察编号时间间隔min吸光度A平均吸光度ASDRSD%150.50220.4973 0.0046 0.94 2150.49823250.49544350.50065450.48916600.49845.3重复性试验取一份药材约0.5g，精密称定，分别精密量取6份供试品溶液0.5ml，供试品制备方法制备溶液，在最大吸收波长下测定吸光度，按测定数据求出多糖含量，并求算平均含量和RSD。表4 重复性考察样品编号取样量g吸光度A含量mg平均含量mgSDRSD%10.50190.50125.19 5.20 0.04 0.77 20.50230.50935.25 30.50200.50535.22 40.50230.50895.25 50.50250.49785.16 60.50230.49765.16 5.4加样回收率试验精密称取同一批号的样品约0.25g，共6份，分别精密加入对照品储备液2.5ml，按照供试品制备方法制备溶液，照标准曲线制备项下的方法，依法显色，测定吸光度，按测定数据求出各自的多糖含量，并得到回收率及RSD。表5 加样回收率考察编号取样量g原有量mg加入量mg吸光度A测得量mg加样回收率%平均加样回收率%SDRSD%10.25342.5952.50.50225.1946103.984101.171.861.8420.25672.5932.50.50325.2022100.1930.25862.5982.50.50645.2265101.1440.25442.5742.50.50875.2439102.7950.25552.5922.50.50125.187199.3560.25672.5992.50.50235.195399.58样品溶液的制备 取灵芝孢子粉粉末（过四号筛）0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加水90ml，加入回流3h，放冷，摇匀，精密量取50ml，加入乙醇150ml，摇匀，4放置12h，取出，离心，倾去上清液，沉淀加水溶解并转移至150ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，为供试品溶液。测定 分别精密吸取0.5ml样品溶液至试管中，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml浓硫酸，加蒸馏水至刻度，振摇5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，以蒸馏水为空白对照，在最大吸收波长处测定吸光度，从标准曲线上读出样品溶液中含多糖的含量，计算其含量，即得。表6 不同产地灵芝孢子粉样品的多糖含量药材批次编号取用量g取样体积（mL）吸光度A含量mg多糖总含量（%）平均含量（%）SDRSD%大丰10.5027 0.50 0.63306.19 1.24 1.24 0.010.08 20.5028 0.50 0.63426.19 1.24 30.50260.50 0.6340 6.19 1.24 吉林长春10.50160.50 0.4949 5.14 1.03 1.02 0.010.35 20.5013 0.50 0.4902 5.10 1.02 30.50190.50 0.4924 5.12 1.02 亳州10.5014 0.50 0.5693 5.70 1.14 1.14 0.01 0.14 20.50160.50 0.5709 5.71 1.14 30.5012 0.50 0.56895.70 1.14 山东济宁10.5030 0.50 0.86337.93 1.59 1.59 0.010.31 20.5029 0.50 0.8604 7.91 1.58 30.5028 0.50 0.8668 7.96 1.59 山东春江10.50160.50 0.5053 5.22 1.04 1.04 0.01 0.03 20.50200.50 0.5057 5.22 1.04 30.50240.50 0.5053 5.22 1.04 金寨10.50280.50 0.99198.90 1.78 1.78 0.01 0.05 20.50320.50 0.99298.91 1.78 30.50300.50 0.99288.91 1.78 霍山一品堂10.50150.250.564511.33 2.27 2.28 0.01 0.55 2