自动化制备11C-PIB及其初步临床应用-修改后.doc

改良在线自动化制备淀粉样蛋白显像剂11C-PIB及临床初步应用 张政伟 华逢春 姚志文 蒋雨平 王坚 胡明杨 赵军 刘平 薛方平 管一晖#复旦大学附属华山医院PET中心 上海 200235注明为何课题的支持目的：在原有的化学合成模块基础上研究脑PET AD显像剂11C-PIB的自动化制备路线，并进行初步临床应用研究验证药物的有效性。方法：采用氢化锂铝/四氢呋喃（LAH/THF）还原法制得的11C-碘代甲烷（11CH3I）在线转换成活性更高的11C-三氟磺酸甲酯（11CH3OTf），通入锥形反应瓶内和1.0 mg PIB前体6-OH-BTA-0丁酮溶液在盐冰浴条件下反应，利用改进的HPLC方法纯化产品，并对最终产品进行质量控制。用昆明小鼠进行急性毒性试验，并行4例临床病人及1例正常人PET/CT显像。结果：改进后的自动化制备工艺，最终得到可供注射的11C-PIB 10%乙醇溶液，与改进前相比 具体的结果？；初步临床研究表明可以用于阿尔茨海默病诊断。关键词：正电子发射断层扫描显像 阿尔茨海默病 N-甲基-11C2-4-(甲氨基)苯基-6-羟基苯并噻唑Abstract Objective To develop an auto-synthesis method for the on-line preparation of amyloid-beta(A) plaques image agent 11C-PIB. Methods A intermediate, 11CH3OTf made from 11CH3 which was produced from 11CO2 with LAH/THF, was bubbled into 1.0 mg precursor, 6-OH-BTA-0 in salt-ice condition. The final crude product was then purified though prep-HPLC to get purified product. The human images were obtained in 1 case of AD and 1 normal volunteer. Results The total synthesis process took about 35 min. The synthesis yield (EOB) was 203% (not correct), the radiochemical purity over 98%, and the specific activity about 5.55GBq/mmol. Conclusions The modified automated preparation of 11C-PIB was verified in producing 11C-PIB of high radiochemical purity and synthesis yield in a short time. The result support that this promising product could be used in clinical imaging Key words: PET； Alzheimers disease； 11C-PIB阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一种进展性的神经变性疾病，表现为不可逆的认知功能丧失、记忆障碍和行为改变。目前对于AD患者，还没有精确的诊断标准，只能根据尸解的病理脑切片观察作为诊断“金标准”。AD患者脑组织中存在特征性的-淀粉样蛋白（-amyloid，A）沉积性老年斑和神经纤维缠结增多。因此，A活体检测的实现，不仅能帮助诊断AD，也可以动态监测AD的发展过程。A特异性显像剂，是当前AD的正电子发射断层扫描（positron emission tomography，PET）显像研究之热点，Mathis1等在2001年首次合成N-甲基-11C2-4-(甲氨基)苯基-6-羟基苯并噻唑（11C-PIB，也称为11C-6-OH-BTA-1）后，研究人员2-6先后对制备方法进行探索和改进，目前采用的方法多用11CH3OTf对PIB标记前体6-OH-BTA-0进行甲基化标记，然后采用乙腈水溶液做流动、制备HPLC进行分离纯化，收集的成分用C-18小柱对除去乙腈。由于该工艺操作繁琐，实现自动化合成困难。本文对该制备工艺进行改进，现报道如下。材料与方法1. 主要试剂1.0 mol/L氢化锂铝/四氢呋喃（LAH/THF）溶液(德国ABX公司)；氢碘酸（HI）质量分数60HI AR（Aldrich公司)；丁酮，（分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司），乙腈（HPLC级，中国医药集团上海化学试剂公司）。无水乙醇（USP级，美国Aldrich）、PIB标记前体6-OH-BTA-0和PIB标准品购自于德国ABX公司。2. 仪器与耗材回旋加速器（RDS111，美国CTI 公司）；PET-II 型自动化碘代甲烷仪（江苏大华电气有限公司）。CRC-15R型放射性活度检测器（美国Capintec公司）；分析型高效液相色谱仪：Waters公司，LB508型放射性检测器（Berthold公司）；Xterra RP反相C18柱（5mm，3.9150 mm）；制备型高效液相色谱仪：德国公司，UV检测器，Xterra RP反相C18柱（10 mm，19150 mm）。无菌滤膜Millex-GS（Millipore公司）；3. 标记中间体11C -三氟磺酸甲酯（11CH3OTf）的制备：采用核反应14N (p ,) 11 C在加速器靶内生成11COx ，传到放入液氮的Loop环内，捕获完毕后，移开液氮。通过PET-II型自动化碘代甲烷仪，11COx缓慢传至装有0.2 mL的 1.0 mol/L氢化锂铝/四氢呋喃溶液反应管中反应，蒸发多余的四氢呋喃后加入0.3-0.4 mL的HI，生成的11CH3I由氮气载带，经过干燥处理，11CH3I蒸汽通过灼热的三氟磺酸银转换成11CH3OTf7。反应式如下图： 图1：标记中间体的反应路线说明一下改进的内容在哪里，在结果中最好和传统方法比较一下4. 放射性标记11C-PIB及HPLC纯化反应瓶法：参考Solbach4等的方法，使用1.0 mg PIB标记前体（6-OH-BTA-0）溶于0.5 mL丙酮中，摇匀后装于3.0 mL的特制密闭锥形反应瓶内，置于盐冰浴中。反应瓶入口端通入11CH3OTf的氮气流，出口端接尾气吸收装置。待反应瓶所测放射性最大，将密闭反应瓶置入80水浴中加热1 min后，加入60%乙醇溶液中止反应。中止后的11C-PIB粗产品使用制备HPLC分离纯化，固定相：Xterra RP反相C18柱；流动相：60%乙醇溶液。最终收集的产品用生理盐水稀释乙醇质量分数为10%后，经微孔无菌滤膜过滤，得澄清可供注射的 11C-PIB溶液。图2：11C-PIB标记反应路线5. 自动化标记工艺：11CO2由回旋加速器生产，由高纯氮气载带，使用国产自动化碘代甲烷仪制备成11CH3I，然后在线转换为11CH3OTf，经过P2O5柱干燥，传入锥形反应瓶中（该反应瓶处于盐冰浴）。11C-CH3OTf传输结束，移开盐冰浴，80水浴1 min。使用注射器加入3mL 60%乙醇溶液稀释，然后加入至HPLC的LOOP环内制备，以紫外检测器和放射检测器检测图谱，需要的峰型出现时，打开产品收集阀门，纯化后的11C-PIB乙醇溶液稀释后经无菌滤膜过滤后收集备用。整个标记需要的仪器都放在热室内，制备人员通过远程控制不需要接触放射性。6. 放射化学纯度的测量 物理性状的说明？HPLC方法测量条件：Waters分析型HPLC，流动相：50%乙腈溶液，流速0.6 mL/min， 紫外吸收在254 nm。以PIB标准品配一系列标准溶液，确定放射性峰的性质和浓度。未反应的C-11参考Rt为2.9min，未反应的PIB前体产品参考Rt为4min ，最终产品11C-PIB参考Rt为5.0min。7. 小鼠急性毒理实验 补充其他生物注射前的实验 如鲎实验、细菌培养等6只昆明小鼠，尾静脉注射11C-PIB 0. 5ml，观察注射后小鼠的反应，并称重。饲养、观察1 周后称重并处死，解剖，取主要器官做病理检查。8. 临床试用：另补一下伦理的过程1例临床拟诊AD患者及正常人1例，患者MMSE评分为。肘静脉注射370MBq的11C-PIB，仪器SIEMENS BIOGRAPH 64 HD PET/CT扫描仪，注射后30min后采集，3D动态采集，iterative重建后分别得到水平、冠状和矢状面图，取45-55分钟图像显示，层厚为3mm。数据处理：视觉分析法，直接分析脑内断层的放射性分布。另患者隔天注射18F-FDG 7mCi，30分钟后行PET/CT显像，重建后得到图像进行对比。结 果1. 11C-PIB制备比较的内容最好表格化从11CO2传到合成器上生产11CH3I并在线转换成11CH3OTf，PIB前体捕获11CH3OTf，到粗产品的转移、纯化，11C-PIB制备为全自动化完成，从11CH3OTf到可供注射的11C-PIB用时22 min。将0.5mg前体溶于丁酮，反应瓶内的标记效率（EOB）为203 %( n16)。采用Loop方法自动化制备11C-PIB，合成效率下降到15%.由于11CH3OTf为气体，为了减少与PIB前体反应时的损失，在传输时，采用盐冰浴。由于使用制备型HPLC，产品用HPLC没有测到杂质峰。在线自动化制备的11C-PIB放化纯度大于98%，比活度大于2000GBq/mmol。pH在67左右，衰变后溶液检查符合无菌和热源要求。完成多少次标记 结果如何？2. 11C-PIB的鉴定及放化纯度测定HPLC的测量结果如下图3：PIB标准品的UV峰与11C-PIB放射性峰的保留时间一致。 图4：11C-PIB的HPLC图谱3. 小鼠急性毒理实验6只昆明小鼠注射后无任何中毒症状，1 周内无一死亡，主要器官病理切片检查无异常。有否结果？4. 临床初步应用：上排为FDG PET显像，可见双侧颞顶叶、额叶FDG弥漫性减低，下排见相应的部位11C-PIB明显积聚。正常人全脑皮质内未见明显11C-PIB积聚。副反应的描述如注射时疼痛等 生命体征平稳等讨 论本研究同以往文献制备 11C-PIB相比有以下特点：（1）采用11CH3OTf提高了标记效率1-2，达到203 %（EOB）。（2）采用60%乙醇溶液替代有毒的乙腈溶液作为制备HPLC流动相自动稀释反应液并将从反应液从反应瓶中转移和纯化，节约时间，减少了多次转移所致放射性损失。（3）实现了全程自动化制备。用碘代甲烷模块（在线转换成11CH3OTf）和制备型HPLC连接，可以很方便生产可供临床使用的11C-PIB注射液。制备11C-PIB的方法，早期使用11CH3I做标记中间体，由于在制备过程中要对PIB前体6-OH-BTA-0中羟基基团进行保护，去保护，造成制备过程繁琐，不太适合临床的大量使用。目前多使用11CH3OTf作为标记中间体，避免了制备过程中的保护、去保护过程，使得制备简便，与文献5相比，使用制备HPLC取代C18小柱，使产品纯度更高，适合于人体研究。与文献6相比，使用乙醇溶液取代乙腈溶液作为制备HPLC的流动相，制备过程更见简化，同时最终产品完全不含乙腈，安全性更高。临床的研究表明。国产化的前景补充。参考文献1. Mathis, C.A., Holt, D.P., Wang, Y., et al., Lipophilic. 11C-labelled thioflavin-T analogues for imaging. amyloid plaques in Alzheimers disease. J Label. Compd Radiopharm, 2001. 44 Suppl：26-28.2. Mathis CA,Wang YM,Holt DP,et al.Synthesis and evaluation of 11C-labeled 6-substituted 2-arylbenzothiazoles as amyloid imaging agents.J Med Chem,2003,46:2740-2754.3. Wilson A. A.,Garcia A,Chestakova A,et al. A rapid one-step radiosynthesis of the -amyloid imaging radiotracer N-methyl-11C2-4-methylaminophenyl)-6-hydroxybenz othiazole (11C-6-OH-BTA-1) J. Label. Compd. Radiopharm. 2004, 47:679-682.4. Solbach C, Uebele M, Reischl G,et al. Efficient radiosynthesis of carbon-11 labelled uncharged Thioflavin T derivatives using 11Cmethyl triflate for -amyloid i