《生物技术大实验》doc版.doc

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保持安静，精心操作，认真实习。三、 讲究卫生，严禁吸烟，药品废物不乱丢乱倒。四、 注意节约，不随意浪费药品及试材。五、 爱护公物，使用仪器，用前检查，用后归还，用完的玻璃器皿应及时清洗。六、 注意安全。使用电器要特别小心谨慎；离开实验室要关好水电门窗。目录前言11实验目的12实验内容13实验流程24材料34.1仪器与用品34.2 试剂34.3 材料64.3.1 菌株和质粒64.3.2 植物材料64.3.3 生化试剂与寡核苷酸引物64.3.4 引物64.4步骤与方法74.4.1 拟南芥叶片组织培养74.4.1.1 培养基的配制74.4.1.2接种74.4.2大肠杆菌感受态的制备及转化84.4.3质粒的小量提取94.4.4质粒的酶切检测104.4.5 土壤根癌杆菌感受态的制备（CaCl2）及转化104.4.6 PCR挑选转化子114.4.7 琼脂糖凝胶电泳检测124.4.8 菌种保存134.4.9 叶盘法转化拟南芥134.4.10植物DNA的小量提取144.4.11 转基因植物的PCR检测155 作业17前言 在迄今发展起来的转基因技术中，农杆菌介导的遗传转化占据主导地位，应用最为广泛，特别是在双子叶植物上尤其普遍。近几年来农杆菌转化在水稻等谷类作物上取得成功，其应用范围将进一步扩大。农杆菌介导的优点是转化频率高，可转移较大的DNA片段，所转移DNA很明确地为T-DNA左右边界之间的序列，并可直接用不同的植物组织进行基因转移，不需要原生质体培养再生植株的技术，从而提高转育周期。拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于这种植物具有以下特点： （1）形态个体小，高度只有3Ocm左右； （2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需6周左右； （3）种子多，每株每代可产生数千粒种子； （4）形态特征简单； （5）基因组小，只有5对染色体。本实验以拟南芥为受体材料以根癌农杆菌为介导，实现外源基因的导入。使学生掌握目前使用最为普遍的农杆菌介导外源基因导入植物的方法。1、 实验目的：把生物技术基因工程方向专业基础课、专业课的实验联系起来，从而使学生对植物基因工程的操作技术有初步的、整体的感性认识，掌握目前使用最为普遍的农杆菌介导外源基因导入植物的方法，并达到理论联系实际、理论指导实践的目的。2、实验内容：1） 组织培养；2） 质粒转化大肠农杆菌；3） 质粒提取；4） 酶切检测；5） 质粒转化根癌农杆菌；6） PCR挑选转化子；7） 植物基因组DNA提取。8） PCR检测。3、实验流程：表达载体的构建（用基因工程操作中所得的结果） 转化大肠农杆菌（DH/5）提取质粒酶切检测转化根癌农杆菌(LBA4404) 拟南芥培养 PCR检测 取外植体转化拟南芥外植体 组织培养获得再生植株 提取植物DNA PCR检测4材料4.1仪器与用品冷冻高速离心机、恒温摇床、低温冰箱、超净工作台、电泳仪、PCR仪、鼓风干燥箱、高压湿热灭菌锅、电光分析天平（感量为0.0001g）、杂交仪、PH计、移液枪、枪头（200ul、1ml、5ml）、1.5ml离心管、500ml三角瓶、量筒（20ml、50ml、100ml）、牙签、培养皿、烧杯（50ml、100ml、500ml）、容量瓶、三角瓶、镊子、手术刀、药勺、玻璃棒、透气封口膜、橡皮圈、酒精灯。4.2 试剂 1、Cell Lysis Solution ： 0.2mol/L NaOH 1% SDS 2、Cell Resuspension Solution ： 50mmol/L Tris-HCl ( PH=7.5 ) 10mmol/L EDTA 100ug/ml RNase 3、Neutraliztion Solution ： 1.32mol/L NaAc ( PH=4.8 ) 4、LB液体培养基 ： 蛋白胨 10g/L 酵母浸膏 5g/L NaCl 10g/L 5、YEB液体培养基 ： 蛋白胨 5g/L 酵母浸膏 1g/L 牛肉浸膏 5g/L MgSO47H2O 0.493g/L6、大量元素母液配方（母液）NH4NO3 33000mg/LKNO3 38000mg/LCaCl2.2H2O 8800mg/LMgSO4.7H2O 7400mg/LKH2PO4 3400mg/L 7、微量元素母液配方（母液）KI 166mg/LH3BO3 1240mg/LMnSO4.4H2O 4450mg/LZnSO4.7H2O 1720mg/LNa2MoO4.2H2O 50mg/LCuSO4.5H2O 5mg/LCoCl2.6H2O 5mg/L 8、铁盐母液配方（母液）FeSO4.7H2O 5560mg/LNa2.EDTA.2H2O 7460mg/L 9、有机物母液配方（母液）肌醇 20000mg/L烟醇 100 mg/L盐酸吡哆醇 100 mg/L盐酸硫胺素 80 mg/L 甘氨酸 400 mg/L 配制母液时，按各母液配方用量称取药品，分别用重蒸馏水定容至L； 每制备L培养基，取母液50ml，母液5ml，母液5ml，母液5ml。 （注: 母液、置于冰箱中C保存，母液常温避光保存）10、激素母液配制a.BAP（苄氨基嘌呤）1 mg/Lb.NAA（萘乙酸）0.1 mg/L11、提取缓冲液( 1) 500ml 终浓度glucose 34.68g 0.35mol/L Tris-HCl （1mol/L PH8.0） 50ml 0.1mol/LEDTA （0.5mol/L PH8.0） 5ml 0.005mol/LPVP 40 10g 2%DIECA（二乙基二硫氢基甲酸） 0.5g 0.1% 12、裂解缓冲液 500ml 终浓度Tris-HCl （1mol/L PH8.0） 50ml 0.1mol/L NaCl 40.95g 1.4mol/L EDTA （0.5mol/L PH8.0） 5ml 0.005mol/L CTAB 10g 2% PVP 40 10g 2% DIECA（二乙基二硫氢基甲酸） 0.5g 0.1%13、其他试剂 ： 70%乙醇氯仿：异戊醇（24：1）无水乙醇异丙醇液氮去离子无菌水0.1%升汞（氯化汞）1 mg/L NaOH1 mg/L HCl70%酒精、蔗糖、琼脂、吐温、洗衣粉10PCR buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、EB（溴化乙锭）、溴汾蓝4.3 材料4.3.1 菌株和质粒大肠杆菌(Escherichia coli) DH5a、根癌农杆菌菌株 (Agrobacterium tumerfaciens) LBA4404（含辅助质粒pBA4404）以及含有含对同翅目的蚜虫有特异抗性的编码尾穗苋凝集素基因(ACA)和雪花莲凝集素基因（GNA）的中间表达载体pCAMBIA2300-AG（载体基因构成见图2-1）由张汉尧老师提供。RBNPTII-Nos3DE35SGNANos3LBDE35SACANos3 含GAN和ACA基因植物表达载体的结构4.3.2 植物材料用于转化实验的植物材料为拟南芥。4.3.3 生化试剂与寡核苷酸引物各种限制性内切酶购自Promega等公司；PCR和测序引物由上海生物工程公司合成；Taq DNA聚合酶购自上海生物工程公司；其它生化试剂购自国内外有关厂家和公司。4.3.4 引物GNA的引物:正链引物： 5-GAAGCCGGTCTTGCGATG-3 负链引物： 5-G AAATTCCCCG GTAGAGAGAG-3可扩增出500bp左右的片段。ACA的引物: 正链引物： 5-CTGACGTAAGGGATGACGC-3负链引物： 5-CTAACCAAATATTTGTTAGTG-3 可扩增出370bp左右的片段。4.4步骤与方法4.4.1 拟南芥叶片组织培养4.4.1.1 培养基的配制1、 分别加入母液50ml，母液 25ml，母液 5ml，母液 5ml，按规定量加入生长调节物质；2、 称取6.5g琼脂和30g蔗糖，加水至600ml，在恒温水浴加热使之溶解。加蒸馏水至1L；3、 充分混合后，用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl调节培养基的PH值到5.8，把培养基分装到培养瓶中，每瓶50ml左右；4、 用透气封口膜盖严瓶口；5、 把已分装好的培养瓶放入灭菌锅中，121条件下灭菌20min。6、 对接种操作中所需的剪刀、镊子、口罩、培养基、吸水纸、白瓷缸、蒸馏水、培养皿等用报纸包扎好放入高压湿热灭菌锅内，于121C下灭菌15min， 取出后将玻璃器皿及剪刀等置于鼓风干燥箱内烘干待用。4.4.1.2接种1、培养材料的灭菌(1) 将所有要用的物品如：接种用具、无菌蒸馏水、培养基等置于超净工作台上，打开工作台开关，确认工作台正常送风后，开机30min，然后用紫外线照射15min进行灭菌。(2) 从花盆内选取生长健壮无病虫害的幼嫩叶片和茎段，用洗衣侵泡3-5min，用自来水清洗，细流水冲洗过夜；(3) 进入接种室前，用肥皂洗手，戴上口罩、帽子，用70%酒精棉球把手和指间消毒1次；(4) 将经过预处理的植株组织块置于白瓷缸内，注入0.1%升汞溶液，用量以盖过材料为宜，再滴加2滴吐温，盖上盖，侵泡10-15min，期间摇动两三下；(5) 消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，如此重复三次；(6) 将材料取出，置于一个已灭过菌的培养皿中，用经过火焰灼烧并冷却的剪刀和镊子将叶片切成1cm大小，带腋芽的茎段切割成1cm长短；(7) 打开培养瓶封口膜，瓶口置于酒精灯火焰上烘烤数秒钟，迅速将外植体接种到培养基上，再将瓶口置于酒精灯上烘烤数秒，立即用封口膜封严；(8) 将已接种的培养瓶移入培养室，在培养架上整齐排列，25C恒温培养，光照时间12h/d。4.4.2大肠杆菌感受态的制备及转化（CaCl2感受态）1. 准备工作200l、1ml、5ml枪头各一盒，1.5ml离心管一盒，50ml离心管6个；5ml LB试管4根，100ml LB液体培养基（500ml三角瓶装）两瓶；溶液配置：CaCl2 0.1M 100mlCaCl2 0.1M Glycerol 10% 100ml灭菌备用。2. 操作步骤：1) 接大肠杆菌DH5单菌落至5ml LB试管中，37，300rpm振荡培养12小时；2) 将菌液转移至100ml液体培养基上，37，300rpm振荡培养100min；3) 当菌液O.D.值达到0.5-0.6时，将菌液转移至50ml离心管中；4) 冰浴 30min；同时将冷冻离心机温度调至4，其它待用物品都置于冰上待用；5) 4，8,000rpm离心15min，弃上清，留菌体；6) 每个离心管中加入冰预冷的0.1M CaCl2 10ml，快速重悬菌体，尽量保持低温；7) 4，8,000rpm离心15min，弃上清，留菌体；8) 每个离心管中加入冰预冷的0.1M CaCl2 10%Glycerol 2ml，快速重悬菌体，尽量保持低温；9) 在冰预冷的每个离心管中加入200l菌液，液氮速冻后保存于-70冰箱备用。3. 转化1) 取出保存的感受态细胞在冰上融化；2) 将连接物10l加入到感受态细胞中；3) 冰浴30min；4) 42水浴90sec；5) 冰浴2min；6) 加入800l的液体LB，37，120rpm振荡培养1小时；7) 涂板，37倒置暗培养16小时。4.4.3质粒的小量提取1、 在含有卡那霉素的平板上用牙签挑取单菌落，接种到10ml装有LB液体培养基的离心管中，4000rpm，离心15min；2、 加入250ul的Cell Resuspension Solution重悬菌体，加入4ul RNase(10mg/ml ),尽量打散菌体，不留菌块；3、 再加入250ul的Cell Lysis Solution ，混匀，动作要轻，勿剧烈震荡；4、 加入350ul的Neutraliztion Solution，混匀，轻轻打散沉淀，勿剧烈震荡；5、 4，12000rpm，离心10min；6、 弃沉淀，取上清，加入0.8倍体积的氯仿：异戊醇（24：1），混匀；7、 4，12000rpm，离心15min；8、 取上清，视情况是否进行氯仿：异戊醇（24：1）的二次抽提；9、 加入0.8倍体积的异丙醇，室温沉淀20min或加入两倍体积的无水乙醇，-20沉淀20min；10、 4，12000rpm，离心15min；11、 加入500ul的70%乙醇洗涤，重复两次，自然晾干34h；12、 加入80-100ul的去离子水， -20保存备用。 4.4.4酶切检测1、在1.5ml的离心管中加入如下成分：无菌去离子水 19L10buffer 10LDNA底物 20LEcoR限制性内切酶(10U/L) 1L终体积50L。2、37反应2h；3、65反应20mins以灭活酶的活性；4、加入等体积的酚-氯仿1：19(V/V)混匀；5、4，12000rpm离心10mins。转移上清液至新的干交净离心管中；6、加入等体积的氯仿，混匀；7、4，12000rpm离心10mins。转移上清液至新的干交净离心管中；8、加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体3M的NaCl, 4沉淀DNA过夜；9、4，12000rpm离心20mins，弃上清液，收集并彻底干燥DNA沉淀，加适量的无菌水溶解DNA沉淀；10、在1的琼脂糖凝胶上，检测酶切结果。4.4.5土壤根癌杆菌感受态的制备（CaCl2）及转化1. 准备工作：200l、1ml、5ml枪头各一盒，1.5ml离心管一盒，50ml离心管6个；5ml YEP试管4根，100ml YEP液体培养基（500ml三角瓶装）两瓶；溶液配置：NaCl 0.15M 100mlCaCl2 0.02M Glycerol 10% 100ml2. 操作步骤：1) 从YEP平板上挑取土壤根癌杆菌单菌落，接种于含有100g/ml利福平的5ml液体YEP试管中；2) 28，300rpm振荡培养12小时；3) 将5ml菌液转接到100ml YEP液体培养基的三角瓶中，28，300rpm振荡培养2小时，至O.D.值为0.5；4) 将培养好的土壤根癌杆菌分装到50ml离心管中，冰浴30min；5) 将冷冻离心机温度调至4，其它待用物品都置于冰上待用；6) 4，8,000rpm离心15min，弃上清，留菌体；7) 每个离心管中加入冰预冷的0.15M NaCl 10ml，快速重悬菌体，尽量保持低温；8) 4，8,000rpm离心15min，弃上清，留菌体；9) 每个离心管中加入冰预冷的0.02M CaCl2 10%Glycerol 2ml，快速重悬菌体，尽量保持低温；10) 在冰预冷的每个离心管中加入200l菌液，液氮速冻后保存于-70冰箱备用。3. 转化1) 取出保存的感受态细胞在冰上融化；2) 将100ng质粒DNA加入到感受态细胞中，混匀；3) 冰浴30min；4) 液氮速冻1min；5) 37水浴3min；6) 加入1ml液体YEP培养基，混匀，28，100rpm振荡培养3h；7) 涂板，28暗培养72h。4.4.6 PCR挑选转化子1、 在含有抗生素的培养基平板上分区并标号；2、 在超净工作台上，用灭过菌的牙签挑取单菌落，分别在各区内划线，37倒置暗培养16小时；3、 准备好PCR体系：10PCR Buffer 2 ul dNTP 2 ul MgCl2 2 ul Taq 聚合酶 0.2ul 引物 1 1 ul 引物 2 1 ul 无菌水 11.8ul 菌体 用牙签挑取少量粘附于管底4、 将PCR管置于离心机中800rpm离心10s，将菌体离心至离心管底部；5、 加入石蜡油，进行PCR： 1） 95 预变性 5min 2） 95 变性 1min 3） 55 退火 50s 4） 72 延伸 50s 5） 从（2）（4）进行35个循环 6） 72 延伸 10min 7） 4 保存4.4.7 琼脂糖凝胶电泳检测1、 制胶 称取0.6g琼脂糖，放入100ml锥行瓶中，按胶浓度加入0.5TBE 缓冲液，于微波炉中溶解； 冷却至60左右，加入终浓度为0.5g/ml的EB，混匀； 将凝胶床水平放置，插入两端挡板，用滴管吸取少量凝胶封好胶床边缘； 放入梳子，使梳齿高于底板0.51.0mm; 倒入琼脂糖凝胶溶液，其厚度为35mm，放置3060min，使胶完全硬化； 去掉两端的挡板，将胶床放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面高出胶面1-2mm，小心拔出梳子，检查样品孔是否完整。2、 加样 取15ul DNA样品，于4ul 加样缓冲液于封口膜上混合； 用20ul 移液枪将样品加入样品孔内； 同样操作在另一样品孔内加入10ul DNA分子质量标准物。3、 电泳 盖上电泳槽盖，接通电源，样品端接负极，以80V电压电泳，当溴汾蓝泳动至胶3/4处时停止电泳，取出凝胶，置于短波紫外线（254nm）下观察，照相4.4.8 菌种保存配制25ml含利福平和卡那霉素的液体YEB培养基，将转化的根癌农杆菌接种进去，28，180rpm 振荡培养16h，取菌液850ul到1.5 ml 离心管中，加入150 ul 无菌甘油，盖严，-20保存备用。4.4.9 叶盘法转化拟南芥1、受体材料预处理(1) 将组织培养得到的新生叶片取出，剪成0.5cm0.5cm的小块，接种在愈伤组织诱导培养基上进行预培养，要求叶片近轴面向下；(2) 预培养2d，当材料切口处刚刚开始膨大时进行侵染。2、农杆菌的培养(1) 从平板上挑取单菌落，接种到25ml附加利福平和卡那酶素的细菌液体YEB培养基（PH=7.0）中，在恒温摇床上，于27C、180rpm培养16h，直到OD值为0.5左右；(2)取菌液1ml接种到100ml新鲜配制的无抗生素的液体培养基中，27C、180rpm培养，OD值达到0.5。3、侵染于超净工作台上，将经过预培养的叶片从培养瓶中取出，放入装有菌液的三角瓶中，侵泡6-8min，以叶片边缘充分湿润为度，取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。4、共培养将侵染过的外植体接种在新配制的愈伤组织培养基上，用封口膜封严，在28暗培养条件下共培养3d。5、脱菌培养和筛选培养将经过共培养的外植体转移到含有500ml/L氨苄青霉素+100ml/L卡那酶素的 愈伤组织培养基上（脱菌同时起到选择作用），封口，放置到培养架上，2000lx25条件下培养。6、继代培养选择培养周后，叶片边缘长出大量愈伤组织，将这些组织块取出，放置在无菌培养皿中，用剪刀切成小块，接种到含有氨苄青霉素和卡那霉素的分化培养基上，诱导生成不定芽。4.4.10植物DNA的小量提取试剂 2CTAB，100mmol/L Tris, 20mmol/L EDTA, 1.4mol/LNacl, 2%PVP, 5M KAC, 异丙醇, CI（氯仿:异戊醇=24:1）,70%乙醇, 0.1TE 。提取DNA流程：取样品0.05g,加入2%的PVP，将样品在研钵中磨碎，转入1.5ml的离心管中；加入1ml 2CTAB，在65的水浴锅中保温60分钟,其间摇动几次；加入300ul 5M 醋酸钾冰浴静置30分钟；在4下12000rpm离心15分钟，上清液转入新管；加入2/3体积CI（氯仿:异戊醇=24:1），缓慢摇动15分钟；室温下10000rpm离心10分钟；上清转入新管中加2/3体积的异丙醇，混合后于室温静置30分钟；将絮状DNA挑出；用70%乙醇洗2次，风干；加0.1TE溶解备用。4.4.11 转基因植物的PCR检测1、植物总DNA的提取 取1g 叶片擦拭干净，置于研钵中，液氮研磨至粉末状； 加入提取缓冲液15ml，再研磨2-3min，转入50ml离心管置于冰上，待全部样品处理完毕 4， 8,000 rpm 离心15min，弃上清，留沉淀 每个离心管中加入裂解缓冲液15ml，重悬沉淀至较为均匀的悬浊液状态 55水浴30min 加入0.8倍体积的 氯仿：异戊醇（24：1），混匀 4， 8,000 rpm 离心15min，取上清 加入10ul RNase (100mg/L)，37或室温沉淀30min 加入0.8倍体积的 氯仿：异戊醇（24：1），混匀 4， 8,000 rpm 离心15min，取上清 加入0.8倍体积的异丙醇，室温沉淀20min或加入两倍体积的无水乙醇，-20沉淀20min 4， 8,000 rpm 离心15min，弃上清 加入5ml的70%乙醇洗涤两次，晾干备用。2、进行PCR检测(1) 准备好PCR体系 10PCR Buffer 2 ul dNTP 2 ul MgCl2 2 ul Taq 聚合酶 0.2ul 引物 1 1 ul 引物 2 1 ul 叶片DNA 1 ul 无菌水 10.8ul (2) 加入石蜡油，进行PCR1） 95 预变性 5min 2） 95 变性 1min 3) 55 退火 50s GNA基因 或 3） 57 退火 50s ACA基因 4） 72 延伸 50s 5）