《生化技术原理教学课件》第十章 免疫分析

第十章 免疫分析,主讲：苏应娟 教授,免疫分析方法是研究免疫学的一种工具。是利用抗体和抗原在琼脂介质中扩散、泳动等反应特性进行的。 优点： 特异性强，分辨率高，应用较普遍,一、抗体的性质 抗原免疫动物产生的抗体是血清-球蛋白的一部分。,可用下面的经典实验证明：,取两份抗卵清蛋白的兔血清，其中一份加入纯化的卵清白蛋白，待抗体沉淀后与另一份兔血清进行电泳图谱比较。结果是在经卵清蛋白沉淀抗体后的血清中，-球蛋白的量大大降低。显然，抗体是存在于血清的-球蛋白部分。 从实验发现，抗体的理化性质及结构是与-球蛋白相近的。,-球蛋白是一组结构相似，但又有差异的蛋白质，通常称之为免疫球蛋白（immunoglobulin）。该蛋白用Ig表示。按其结构和免疫化学方面的差异性，又可分为五类，称之为同类免疫球蛋白。,每一类免疫球蛋白还可分为不同亚类，这些亚类称为同种异型免疫球蛋白。 这类蛋白质的95氨基酸排列顺序是相同的，而明显差别是在肽链之间的二硫键数目、位置和绞链区（连接Fd和Fc碎片的肽段）的氨基酸排列顺序。各亚类还能依据-球蛋白分子与抗原结合部位相邻近区域的结构的不同而进一步分级。,1抗原,是指进入异种机体后，能致敏淋巴细胞、能与抗体发生特异性结合的物质。这种特异性称为抗原性。 抗原性包括： 免疫原性指诱导特异免疫反应的能力 抗原特异性指与抗体特异结合的能力 完全抗原：具有这两种能力的物质 半抗原：有些小分子物质，只有抗原特异性而无免疫原性,（1）抗原的性质, 决定簇抗原分子表面的某些化学基团 作用：直接决定免疫化学反应的特异性 决定特异性的强弱的因素： 1） 抗原分子量和暴露在其分子表面决定簇的量 2）亲水性能 抗原分子量越大，暴露在其分子表面的决定簇越多、亲水性能越好，特异性就越强；反之，则特异性就越弱。, 构象,抗原的空间结构对免疫化学反应的特异性有明显的影响。若抗原（蛋白质）变性或结构松散，都会使抗原的性质发生很大变化。, 异己性,获得抗原的动物和被免疫动物不属同一类，这种抗原称为异己性抗原。 若属同一类动物的抗原，一般无免疫原性，或有弱免疫原性。而异己性抗原，则具有免疫原性。 若获得抗原的动物与被免疫的动物在分类学上相差越远（即亲缘关系相差大），则免疫原性越强。反之，则免疫原性越弱。, 电荷,抗原分于上分布有一定数量的电荷。它可使抗原的亲水性增强，促使抗原与抗体之间的离子相互结合，以利于增加抗原的特异性。,（2）抗原的制备,动物的免疫系统非常敏感，对极微量的抗原也能产生相应的抗体。因此，如需制备一种纯抗体时，就得先制备一种同质性抗原。获得的制品应在聚丙烯酰胺凝胶电泳过程呈一条区带，而无杂带。 如果蛋白质由数个亚基构成，每个亚基也许有多个抗原决定簇，就会产生一组不同比例的抗体，因此，欲得到特异性很高的抗体，就须使用抗原为一种亚基的物质。,为获得理想的抗原，须注意：,（1）最常用的载体蛋白有来自牛和人的血清白蛋白、卵清白蛋白和甲状腺球蛋白等。因为它们溶解度好、决定簇多，免疫原性强，且有适当的结合位点。 （2）小分子物质与蛋白质之间的结合比例控制在 3:1-4.5:1 时，一般认为免疫反应强烈。 （3）当半抗原有多种基团时应选择一种对免疫识别不明显的基团与载体结合。,2免疫,（1）动物的选择 选择年幼、成熟，且健壮的豚鼠、鸡、兔、猴、山羊、绵羊、猪和马等为免疫动物。 需少量血清时，以选用白兔为宜， 大量的血清时，选用羊和马为宜。,马抗血清与抗原反应的比例范围是极其狭窄的，不论抗原过量，还是抗体过量，免疫复合物均呈可溶状态。 兔抗血清与抗原反应的比例范围较宽，当抗体过量时，免疫复合物几乎不产生溶解现象；但当抗原过量时，免疫复合物也会产生部分溶解现象。,（2）佐剂（adjuvant）,指与抗原混合注射入机体后，能增加抗原的免疫性，或能改变免疫反应类型的一种物质。 分类 有机：胞壁酸二肽、多糖类物质和福氏佐剂 无机：明矾 福氏佐剂公认较好，有明显的免疫刺激作用。,免疫佐剂的作用,1）延缓抗原的释放，保护抗原不被水解，佐剂可延长抗原在体内滞留时间，避免频繁注射，有利于高亲和力抗体的产生； 2）活化巨噬细胞并促进巨噬细胞与T和B细胞的相互作用，从而对淋巴细胞有特异性加强刺激的作用； 3）佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；,4）佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理； 5）可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原； 6）可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变； 7）改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。,佐剂的制备条件,1）增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性； 2）佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体； 3）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能； 4）良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。,福氏佐剂（Freunds adjuvant）分为： 不完全的和完全的福氏佐剂 前者是一种油包水的乳剂，即用羊毛脂或甘露糖醇单油酸酯（Arlacela）为乳化剂，加入等体积2Tween 80的水溶液，则可提高乳剂的稳定性； 后者是在不完全福氏佐剂中加入杀死的分枝杆菌（如结核杆菌或卡介苗）制备而成的。, 福氏佐剂的作用,1）油包水乳化剂有助于促进免疫反应的进行。 2）部分保护不稳定抗原，使抗原在体内的吸收期延长，减少加强注射的次数。 3）分枝杆菌增加局部淋巴结的炎症反应，扩大免疫原性，促进高亲和力抗体的形成。,（3）抗原的剂量及免疫途径, 抗原的剂量： 抗原的剂量，对于首次免疫的动物，取决于是否用佐剂。 若不使用佐剂，把100微升至1毫升血清白蛋白注入兔体内，仅能引起微小的反应。 使用佐剂，可引起高效力的反应。对大多数动物，免疫的最佳抗原量在1.0-10毫克/每公斤体重,低剂量抗原有利于早期有选择地产生高亲和力抗体，而高剂量抗原将使动物产生免疫耐受性，导致选择缓慢甚至延长数个月。 抗原注射量太大，或者注射次数频繁是没有好处的，免疫原性好的抗原物质，一般经过2-3个月时间的免疫，即可达到高滴度的抗体效价。, 免疫途径及免疫间隔时间：,一般采取多点（6-8点）、少量（0.05-0.2ml）肌肉或皮下注射方法，均可获得最佳免疫效果。 若抗原量极有限时，则加完全佐剂采用多点（30-50点）注射法，可产生较好的免疫效果。,免疫间隔时间通常为2-6周。 因为从第一次注射抗原到出现抗体血清的延滞期为1-30天。可溶性蛋白的延滞期需5-7天。之后，血清抗体的浓度则以指数速度增加，在9-11天达到最高值。 对普通抗原，在加强注射后9天，可采集血清；但也有的抗原在加强注射后，需要较长的时间才能达到最高值。,从图看出，使用福氏佐剂作为抗原乳化剂比明矾好，使用明矾佐剂者又比不用佐剂的好。,四、抗体的检测,抗体的检测：定性与定量分析。 定性分析抗体的方法：间接血凝法、反向间接血凝法和胶乳凝集法等。 定量分析抗体的方法：放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）、扩散法和火箭免疫电泳法等。,酶联免疫吸附测定（ELISA）,1971年瑞典学者Engvail 和Perlmann，荷兰学者Van Weerman 和Schuurs 分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。 ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。,基本原理,它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。,底物显色 定性或定量的分析,包被,反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体,1,3,4,洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离,2,酶联免疫反应基本原理示意图,ELISA中3种必要的试剂, 固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） 酶标记的抗原或抗体（标记物） 酶作用的底物（显色剂）,ELISA的种类和变化,1. 双抗体夹心法 2. 间接法 3. 竞争法 4. 双位点一步法 5. 捕获法测IgM抗体 6. 应用亲和素和生物素的ELISA,1. 双抗体夹心法,方法： 用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等,ELISA在疾病诊断中的作用,ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒 ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体 ELISA法检测幽门螺杆菌抗体,ELISA试剂盒,五、抗体的纯化,1抗体的收集 如用兔子，有耳静脉放血和颈动脉放血两种。,2分离纯化,收集的抗血清中所含的抗体（即免疫球蛋白）量较低，经过分离纯化后，可提高免疫反应的特异性和灵敏度。 （1）硫酸铵盐析分离法 （2）DEAE-纤维素层析法 （3）亲和层析法,第二节 抗原抗体反应,抗原和抗体在体外进行的反应，又称血清学反应，可借助免疫学方法检测。 对抗原或抗体进行适当的标记。 方法：同位素标记法、酶标记法和荧光标记法等。,1. 同位素标记法,是指将放射性同位素标记到抗原或抗体上，制成标记化合物的方法。 比活性（或比放射性强度）大小，可直接影响测定的灵敏度。 （1）同位素的选择 125I、32P、3H,125I和3H标记物特点比较,（2）标记操作,方法：化学和酶学 化学标记法，须用氯胺T（对甲基苯磺胺N-氯衍生物）试剂，又称氯胺T法。 优点：氯胺T法反应速度快、重复性好、无需有机溶剂或极端pH条件。 避免了蛋白质的变性，在没有非放射性碘等载体的情况下，获得高效率碘化反应能力。,反应机理,碘化反应中，产生一种具强氧化性的阳离子碘（ I+），再通过蛋白质中酪氨酸残基的苯环上带电荷羟基的亲电性取代反应，把放射性碘引入蛋白质分子上。此外，碘在组氨酰咪唑或半胱氨酰巯基上也被取代。,碘化反应后，应马上纯化，以除去游离的碘、还原剂以及未结合的碘氧化产物。用交联葡聚糖G25或G50柱层析进行。,2酶标记法,是利用酶与抗体（或抗原）制成的酶-抗体（或抗原）结合物，测定抗原（或抗体）的一种方法。,使用的酶类应具备的性质：,稳定、易于和抗体或抗原结合，能大量得到，酶活性不受机体组织、血清及其提取物的影响；有快速测定水解底物的灵敏方法。 常用于标记的酶： 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶等,3. 荧光标记法,是利用异硫氰荧光素与抗体或抗原生成的复合物，测定抗原或抗体含量的一种方法。 用荧光素标记时，被标抗体或抗原溶液一定要比较纯，效果才好。 经标记、分离和浓缩后的抗体，以每安培瓶1ml的效量进行分装，贮存于-20，在数月内荧光强度基本不变。,二、 分析方法,1免疫扩散法 该法是根据抗原和抗体在琼脂介质中扩散的结果，对其性质进行分析的一种方法。 包括：双向免疫扩散和单向免疫扩散。,单向单扩散 /单向双扩散,双向单扩散 （放射单扩散）,原理： 抗原或抗体这两种成分中只有一种扩散，将已知抗体与琼脂混合，将抗原置于凝胶孔中，抗原则呈辐射状扩散，在孔的周围与抗体结合，在比例合适的地方形成肉眼可见的沉淀环。当抗体的浓度一定时，抗原的浓度与形成沉淀环的直径成正比。,单向扩散示意图,形成的沉淀环大小与抗原或抗体的浓度相关，应先调整抗体和抗原各自的最适浓度，抗体的最适浓度应使免疫扩散后的沉淀环边缘清晰，且能测出血清中的免疫球蛋白的正常值和最大限度的异常值。,抗体浓度过高，形成的沉淀环直径小；浓度过低，不易检测抗原的最高限浓度。沉淀环的大小与所检测的抗原浓度成正比。抗原浓度过低时，沉淀环太小不易测定，过高时，沉淀环太大，浪费抗体。,双向双扩散（琼脂扩散）,原理： 双向免疫扩散是指抗原和抗体在同一凝胶内部扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。该反应是将抗原和抗体加入同一凝胶中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散。当抗原和抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧型沉淀线。,双向扩散示意图,阳性结果为在抗原孔与抗体孔之间出现沉淀线。若出现几条沉淀线表明抗原与抗体均不是单一组分。 用于：抗原或抗体的定性或定量检测或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。当两种抗原的决定簇完全相同时，则与抗体形成的沉淀线相吻合；若两抗原的决定簇完全不同时，则与抗体形成的沉淀线呈不相关的交叉线；若两种抗原有部分决定簇相同时，则与抗体形成呈部分交叉的沉淀线。,2免疫电泳,常见：微量免疫电泳 对流免疫电泳 火箭免疫电泳 常用的缓冲液：巴比妥缓冲液 作电泳介质的1琼脂糖或琼脂粉溶液也是 用该缓冲液配制的,（1）微量免疫电泳 （micro-immunoelectrophoresis）,是将琼脂电泳与免疫扩散结合起来，用于分析抗原或抗体性质的一种方法。 定性或半定量抗原。,原理,把抗原置于用缓冲液配制的琼脂板中央的孔穴内，电泳后，能使其所含组分按各自的理化性质分成不同的区带。然后再与电泳方向平行的抗体槽中加入的抗体进行扩散。当抗原与相应的抗体相遇并达到等量时，则形成沉淀弧，每一种抗原组分可形成一个沉淀弧，因此形成沉淀弧的数目就相当于抗原混合物中所含不同组分的数目。,（2）对流免疫电泳（counterimmunoelectrophoresis）,应用广泛 优点：比琼脂扩散法灵敏度高，检测样品需要的时间短。 在pH8.6缓冲液中进行电泳时，处在阳极端的抗体-球蛋白的电渗力大于电泳力，故向阴极移动。而处在阴极端的抗原，则向阳极移动。当抗原与相应的抗体相遇时，如果比例恰当，就会产生肉眼可见的沉淀弧或沉淀线。 灵敏度高，时间大大缩短（30-60分钟可见结果）。,条带形成的形状与抗原抗体泳动的速率、分子大小、分子构象、电荷多少等有关。,（3）火箭免疫电泳 （rocket immunoelectrophoresis）,原理：当抗原在电场力的作用下通过含有抗体的琼脂凝胶时，将与相应的抗体形成沉淀弧。而未结合的抗原将继续移动至抗原抗体沉淀弧的先导部分，并溶解复合物再向前移动，直至抗原与抗体反应完毕，便可看到形状似“火箭”的沉淀峰。在抗体量一定时，沉淀峰的高度随着抗原量的增加而增加，当抗原量一定时，沉淀峰的高度随着抗体量增加而降低。利用这一关系可对抗原或抗体进行定量测定。,注意,用小电压（10-20V），避免抗原在孔内扩散 抗体的用量合适： 太低，不能形成完整的火箭峰，出现冲刷现象 过高，表现为抗原量过低，抗原泳动距离短，走不出琼脂孔,3固相免疫吸附法,是把抗原或抗体吸附在固相载体（如纤维素、硝酸纤维素纸、聚苯乙烯、琼脂糖凝胶等）上，用其检测抗体或抗原含量的一种方法。 常用的有：酶联免疫吸附测定法（ELISA） 放射免疫测定法（RIA）,放射免疫测定法（radioimmunoassay）,美国女科学家 R.Yalow1950末发明（胰岛素）1977年获诺贝尔医学奖 依据：标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）与抗体（Ab）可发生竞争性抑制反应，反应形成的有限Ag*- Ab复合物与待测