姜黄中姜黄素类化合物的提取与分离研究.doc

北京大学政学者论文集（2001年） 姜黄中姜黄素类化合物的提取与分离研究袀膄蒃蒀螆膃膂蚆蚂节芅葿羁芁莇蚄袆芀葿蒇螂艿艿蚂螈艿莁薅肇芈蒃螁羃芇薆薄衿芆芅蝿螅袃莈薂蚁羂蒀螇羀 姜黄中姜黄素类化合物的提取与分离研究Research on Extraction and Separation of Curcumins from Curcuma longa化学与分子工程学院98级 张 智 渊摘 要研究了用75%乙醇提取姜黄中姜黄素类化合物的方法，以及采用CHCl3、CH3OH和HCOOH的混合溶液（比例为96:4:0.1）为淋洗剂，用快速吸附柱层析的方法分离姜黄中的姜黄素类化合物。分离所得溶液用TLC鉴定后，用紫外-可见分光光度法测定其中三种主要有效成分的含量，绘出淋洗曲线。姜黄素与去甲氧基姜黄素的分离度和去甲氧基姜黄素与去二甲氧基姜黄素的分离度分别为1.1和3.2。关键词： 姜黄素 快速吸附柱层析 TLCAbstractResearch on extraction of curcumins by 75% ethanol with ultrasonic from Curcuma longa was carried out. From the data (Table 12, Figure 2) we found that one hour is an appropriate time for the extraction. Then, a rapid adsorption chromatography was used to separate the curcumins in the solution, which mainly includes curcumin (1), demethoxycurcumin (2) and bisdemethyoxycurcumin (3). The solution was then concentrated by heating and loaded on the top of dihydrogen phosphate impregnated silica gel in a glass column (20 mm diameter, 450 mm height). The column was eluted (2.5 mLmin-1) with chloroform-methanol-formic acid (96:4:0.1) (5 mL fractions, began at 45 mL ) to give 1 (F2F4), 2 (F10F12) and 3 (F14F19), which were identified by TLC. Each spot on the phosphate impregnated silica gel TLC plates was then excavated and impregnated in 5.0 mL acetone in a tube respectively. After 4 hours, the UV absorbency of each solution was measured and the elution curve was shown (Figure 3). From the curve the separation factors were educed as R12=1.1, R23=3.2. We must admit the result up to now is not very satisfactory, however, we will keep on improving the condition to make higher separation factor R12 and to separate much more single fraction of curcumins.Keywords: curcumins; adsorption chromatography; TLC; Curcuma longa.一、 前言 近年来，姜黄素类化合物(curcumins)的研究工作在国内外都颇受重视。它们是中药姜黄的主要有效成分，含量约占361，主要包括姜黄素(curcumin)、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin)和去二甲氧基姜黄素(bisdemethoxy- .0curcumin)三种。这三种酚类色素相近的结构(苯环间二酮结构与烯酮的互变异构、苯环上的酚羟基)使它们具有多方面相似的药理作用，如抗炎、抗氧化和清除自由基、降血脂，特别是它的抗诱变和抗癌作用，正日益引起人们的重视，成为研究的热点。但是结构上的微小差异(主要是苯环上的烷氧基，见图1 )又使三种姜黄素在抗癌、抗氧化作用等方面的能力有较大差异。例如抑制TPA引起的癌细胞增生去甲氧基姜黄素最佳，其次是姜黄素2；防止细胞脂类过氧化物的形成则是去二甲氧基姜黄素最佳，其次是去甲氧基姜黄素。因此从姜黄中提取出较为纯净的三种姜黄素混合物，再进一步将它们分离，对于实际药品生产将会具有良好的指导作用和应用价值。 用有机溶剂从姜黄中提取姜黄素是目前国内外普遍采用的工艺。但是使用的提取剂和提取条件并不一致。对于三种姜黄素的分离，通常采用的薄层色谱(TLC) 3和高效液相色谱 (HPLC) 4分离的方法。它们的分离效率较高，但是分离量太小，而且成本较高，无法满足工业上大规模生产的要求。我们工作的目的就是用简单可行的方法，得到较纯且较大量的三种姜黄素产品。本文在张超工作的基础上5，对姜黄中姜黄素类化合物的提取与分离进行了进一步的研究。实验中采用快速吸附柱层析6的分离方法，以CHCl3、CH3OH和HCOOH的混合溶液（比例为96:4:0.1）5为淋洗剂，分离得到了姜黄中姜黄素类化合物的三种主要成分。其中姜黄素与去甲氧基姜黄素的分离度和去甲氧基姜黄素与去二甲氧基姜黄素的分离度分别为1.1和3.2。1. curcumin: R1 = R2 = OMe2. demethoxycurcumin: R1 = H, R2 = OMe3. bisdemethyoxycurcumin: R1 = R2 = H图1 姜黄素类化合物的结构式二、 实验仪器与药品1. 实验仪器日本岛津UV-240 紫外-可见分光光度计，Yamato RE-51 旋转蒸发仪，液体快速混合器（北京长安仪器厂），SHZ-3型循环水真空泵，KQ3200 超声波清洗器，台式干燥箱（中国重庆），氮气钢瓶，玻璃层析柱(= 20mm, L=400 mm)。2. 实验药品无水乙醇，无水甲醇，丙酮，三氯甲烷，甲酸，磷酸二氢钠（以上均为分析纯，北京化工厂），姜黄粉末（姜黄药材经研磨、过80目筛），硅胶G（薄层层析用，颗粒度1040 m，青岛海洋化工厂），活性炭（粉末状，使用前150 oC活化4.5小时），硅藻土（化学纯，北京房山陶瓷绘料厂），羧甲基纤维素钠（上海化学试剂厂）。三、 实验方法1. 提取方法的选择分别称取3份姜黄粉末各1.0 g (a, b, c)，加入10 mL75%乙醇。将a静置浸泡12 小时，b于液体快速混合器上振荡12 小时，c用超声波提取2 小时。分别取a，b，c提取液10 L，用75%乙醇稀释至4.0 mL，测定425 nm处的紫外吸收。为了确定超声波提取的合适时间，将1.0 g姜黄粉末加入25 mL的锥形瓶中，再加入10 mL75%乙醇，将锥形瓶置于超声波清洗器中。每隔15 分钟，取10 L提取液，用75%乙醇稀释至4.0 mL后测定其425 nm处的紫外吸收。1. 淋洗剂的选择（1） TLC板的制备 将硅胶G的TLC薄板浸于5% NaH2PO4溶液中，10分钟后取出，晾干，再于台式干燥箱中110 oC活化30 分钟备用。（2） 薄层色谱的比较 将三-1中所得提取液进行TLC分离，分别用不同比例的CHCl3、CH3OH和HCOOH的混合溶液作为展开剂展开。 3. 快速吸附柱层析分离（1） 硅胶的处理将100 g硅胶G加入100 mL 5%NaH2PO4溶液中，再加入200 mL丙酮，搅匀后将硅胶G用水泵抽干，然后置于台式干燥箱中，110 oC干燥、活化40 min。将所得硅胶过200 目筛后备用。（2） 姜黄素类化合物的提取与提取液的浓缩称取28.0 g姜黄素粉末，加入280 mL75%乙醇提取，抽滤后所得提取液用旋转蒸发仪减压浓缩至8.0 mL备用。（3） 快速吸附柱层析分离 于=20 mm，L=400 mm的玻璃层析柱中，以CHCl3、CH3OH和HCOOH（96:4:0.1）的混合溶液为淋洗剂，湿法装填处理过的硅胶G，柱床高H=270 mm，用氮气钢瓶加压，调整压力使流速V=2.5 mLmin-1。待淋洗剂液面与硅胶柱顶端即将齐平时，加入浓缩的姜黄素提取液样品1.2 mL，立即将样品压入硅胶柱，待液面即将与硅胶柱顶端齐平时，加入淋洗剂开始淋洗，加压使流速保持V=2.5 mLmin-1，从有亮黄色溶液流出时，即流出第45 mL溶液时开始用带刻度的离心管接取流出的溶液。每56 mL接一管，共20管，约104 mL。再进一步用TLC法分离并测定每份溶液中姜黄素、去甲氧基姜黄素和去二甲氧基姜黄素的含量。将各管溶液定量的点于TLC板上，以CHCl3、CH3OH和HCOOH（96:4:0.1）的混合溶液为展开剂展开，将每个黄色斑点挖下，分别溶解于5.0 mL丙酮中。测定各丙酮溶液的紫外吸收。四、结果与讨论 1. 提取姜黄素类化合物的方法 实验1的结果如表1、表2和图2所示。表1 3种提取方法所的姜黄提取液的紫外吸收提取方法a. 静置浸泡12 hb. 振荡12 hc. 超声波提取2 h吸光度(425 nm)0.3550.5030.568=425 nm处为姜黄素类化合物的特征峰，可用于测定姜黄素类化合物的总含量。由表1可知，用超声波提取的效果最好，且时间最短。表2 超声波提取的吸光度-时间关系时间（分钟）153045607590105吸光度(425 nm)0.3550.3720.5080.5630.5350.5590.569从表2和图2可见，用超声波法提取液在1小时后基本达到饱和。为防止超声波时间过长而破坏有效成分，确定用超声波提取1小时。2. 淋洗剂的选择实验2的结果如表3所示。由表3可见，用展开剂e，f，g展开所得三种成分Rf值差别较大，可以满意，但是用f，g展开拖尾严重，故e效果最好。这与文献5报导结果一致。由于在快速吸附柱层析实验中填料也选用硅胶G(薄层层析用)，故淋洗剂选用e，即CHCl3、CH3OH和HCOOH混合溶液，比例为96:4:0.1。表3 5种展开剂用于姜黄提取液的TLC分离所得三组分的Rf值编号defgh展开剂组成(CHCl3:CH3OH:HCOOH)96:4:0.396:4:0.196:4:0.0598:2:0.190:10:0.1Rf值姜黄素0.780.690.660.540.82去甲氧基姜黄素0.600.460.490.290.74去二甲氧基姜黄素0.480.310.340.140.66拖尾情况不严重不严重严重严重不严重3. 快速吸附柱层析法分离实验3的TLC定性实验结果为：第24管为姜黄素，第1012管为去甲氧基姜黄素，第1419管为去二甲氧基姜黄素。定量分析结果如表4和图3所示。表4 快速吸附柱层析分离所得流出溶液中3个组分的紫外吸收试管号淋洗体积(mL)吸光度试管号淋洗体积(mL)吸光度A1A2A3A1A2A314511990.1592510.011210400.0953561.0500.024131100.0410.0614611.534141160.0160.2165661.1760.164151210.0090.4556720.9690.363161280.1907770.8820.753171330.1408830.4360.751181380.0649890.0700.361191430.03910940.0170.27620149注：A1表示姜黄素溶液的吸光度（最高吸收峰为420 nm），A2表示去甲氧基姜黄素溶液的吸光度(最高吸收峰为417 nm)，A3表示去二甲氧基姜黄素溶液的吸光度(最高吸收峰为410 nm)。“”表示TLC分离后无相应组分而未进行紫外测定。 计算分离度R. V、W分别表示淋洗曲线中三个峰的峰位置和半峰宽: R12 = 2 (V2V1)/(W1+W2) = 2 (8062)/(18+16)=1.1R23 = 2 (V3V2)/(W2+W3)= 2 (12180)/(16+10)=3.24. 结论用快速吸附柱层析的方法，采用CHCl3、CH3OH和HCOOH的混合溶液（比例为96:4:0.1）为淋洗剂，分离得到了姜黄中姜黄素类化合物的三种主要成分。其中姜黄素与去甲氧基姜黄素的分离度和去甲氧基姜黄素与去二甲氧基姜黄素的分离度分别为1.1和3.2。为满足今后工业生产的要求，还需进一步提高塔板数与柱容量，以提高姜黄素与去甲氧基姜黄素的分离度和进样量。参考文献1. 天津轻工业学院食品工业教学研究室编. 食品添加M, 北京：轻工业出版社（第二版），1985, 111.2. C. Rasmussen, K. Kvist. A Simple and Efficient Separation of the Curcumins, the Antiprotozoal Constituents of Curcuma longa. Planta Med. 66(2000) 396-7.3. 何顺志，丛晓东，金蓉鸾. 中国姜黄属植物根茎中姜黄素类化合物含量测定. 中国药科大学学报 1990；21（2）, 95-98.4. 赵德永，杨模坤，姜黄及其制剂中姜黄素类化合物的高效液相色谱分离及测定. 药学学报 1986；2（5），382-385.5. 张超. 姜黄素、的提取与分离. 北京大学本科生毕业论文.6. (a) W. C. Still, M. Kahn, A. Mitra, J. Org. Chem., 43, 2923 (1978).(b) D. F. Taber, J. Org. Chem., 47, 135 (1982).(c) 利群，赵晨，张滂. 快速吸附柱层析. 大学化学，1986，1: 41-42.致 谢感谢李政道先生及其家人为祖国教育事业做出的努力！感谢导师刘元方教授给我这个机会，使我在较早的时候就能够接触到前沿的科研领域。刘教授严谨的治学态度，渊博的学识，以及巧妙的管理方法都给我留下了深刻的印象，将使我受益终身。感谢王海芳老师对我的悉心指导。王老师对工作的热情，谦和的为人以及惊人的毅力都令人十分钦佩。感谢吴永慧、孙红芳、刘锋、张新祥和裴伟伟等几位老师在实验中对我的指导。这些指导对我拓宽思路和解决难题都有极大的帮助。感谢朱静、张超、王亚俐、姬志强、刘铭钊等几位同学对我的鼓励与帮助！感谢父母、姐姐对我的理解与支持，他们是我工作和学习的坚强后盾。最后再次向所有关心和支持我的人表示衷心的感谢！作者简介张智渊，男，祖籍河南郑州。1979年9月生于陕西省咸阳市。1998年9月进