牛结核病防控课件

牛结核病的防控,毛 树 德 高级兽医师 甘肃省动物疫病预防控制中心,人畜共患传染病名录,中华人民共和国农业部公告 第1149号 二九年一月十九日 牛海绵状脑病、高致病性禽流感、狂犬病、炭疽、布鲁氏菌病、弓形虫病、棘球蚴病、钩端螺旋体病、沙门氏菌病、牛结核病、日本血吸虫病、猪乙型脑炎、猪型链球菌病、旋毛虫病、猪囊尾蚴病、马鼻疽、野兔热、大肠杆菌病(O157 : H7)、李氏杆菌病、类鼻疽、放线菌病、肝片吸虫病、丝虫病、Q热、禽结核病、利什曼病。,危害,经济损失巨大 例如患病奶牛的寿命要比健康牛短得多，产奶量显著减少，常常不能怀孕。 如果该病未能控制，其病死率可达1020。 在执行本病的防治措施是要花费很大的人力和物力。 公共卫生问题 结核病牛往往是人感染结核病的重要传染源。,美国,1917年开始根除计划， 以50年间花费4.5亿美元根除了牛的结核病。野生动物仍感染牛结核。 英国每年花费7400万英镑用来控制牛结核监测。 澳大利亚1970年开始根除计划，1997年历时27年，根除了牛结核病。 牛结核是可以控制的，但由于自然疫源性的存在，根除是比较困难的。,世界动物卫生组织（OIE）将其列入B类动物疾病 我国农业部96号令将其列入二类疫病。 动物结核病诊断技术 GB/T 18645-2002 牛结核病防治技术规范 农业部 农业部2011年国家动物疫病监测计划要求,法律地位,病原,病原为结核分支杆菌。本菌分为三型，即牛型、人型及禽型。这三种杆菌都可感染人、家畜、家禽。 牛型主要侵害奶牛，其次是黄牛、水牛、牦牛；另外还可感染鹿、马、猪、羊、骆驼、犬、猫等家养哺乳动物和野猪、野牛、松鼠、猴、羊驼、獾、狒狒、狮子、大象等50种温血脊椎动物和20多种禽类，人也不例外。,伯杰细菌学鉴定手册,分枝杆菌属为2 大类: 缓慢生长分枝杆菌 快速生长分枝杆菌（通常不致病）,缓慢生长分枝杆菌,结核分枝杆菌复合物(或群) 结核分枝杆菌 牛分枝杆菌 非洲分枝杆菌 田鼠分枝杆菌 麻风分枝杆菌 禽结核分枝杆菌 副结核分枝杆菌 ,快速生长分枝杆菌（ NTM ）,目前发现NTM有150多种，仅20余种致病。 代表性菌种为 日内瓦分枝杆菌 致HIVAIDS发生播散型NTM病，并迅速致死。I群一光产色分枝杆菌 代表性菌种有：堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿猴分枝杆菌。 群一暗产色分枝杆菌 代表性菌种有：瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、苏加分枝杆菌。 群一不产色分枝杆菌 代表性菌种有鸟一胞内复合体分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、土地分枝杆菌、嗜血分枝杆菌。 群快速生长分枝杆菌 代表性菌种有：偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌。,宿主,牛分枝杆菌 主要引起牛结核病。 也引起人类结核病。有5% 10% 以上的人结核是由牛分枝杆菌引起。 还可感染牛、猪、人、鹿和大象等50 种温血脊椎动物。 20 多种禽类。 结核分枝杆菌 主要引起人类结核病, 参考菌株为H37Rv; 田鼠分枝杆菌 引起鼠类结核病; 非洲分枝杆菌 引起人类结核病。,流行特点,病牛尤其是开放性结核病牛为主要的传染源。 本病一年四季均可发生，多为散发或地方性流行。,主要感染途径为呼吸道和消化道。 相对来说，成年牛易经呼吸道感染，而青年牛易经消化道感染。 呼吸道感染主要由带菌尘埃或气溶胶所造成。 消化道感染则常因饲草、饲料被污染。 犊牛感染主要是吮吸带菌的乳汁造成的。 此外，也可通过交配感染。,传染途径,流行病学,传染原：开放性结核病牛是主要的传染源 引起牛结核病原 牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、禽结核分枝杆菌。 引起（人）结核病原 结核分枝杆菌、牛型结核杆菌、禽型结核杆菌 其他动物结核病原 灵长类与人相似 其他哺乳动物与牛相似、禽类以禽型结核杆菌为主,症状,本病潜伏期长短不一，一般为1045天，长的达数月。甚至长达数年。通常呈慢性经过。 临床上常见的类型有： 肺结核（以长期顽固性干咳为特征 ）、乳房结核（乳房表面现大小不等、凹凸不平的硬结 ） 、肠结核（以持续性下痢或与便秘交替出现为特征 ）、淋巴结核 、生殖器官结核、脑结核,症状,临床症状只能提示但不能确定该病。 牛型结核分枝杆菌感染初期或轻度感染时，可能不出现临床症状。 当病情进一步发展，产生渐进性消瘦、淋巴结肿大、咳嗽及其它症状，这些症状与感染的器官有关。 潜伏期 一般为1045天，长的可达数月甚至数年。 通常呈慢性经过，病初症状不明显，患病较久，由于患病器官不同，症状亦不一致。,咳嗽 病牛常发肺结核，易疲劳，常有短而干的咳嗽，尤其当起立、运动、吸入冷空气或尘埃时 随后咳嗽加重，频繁且表现痛苦。呼吸次数增多或发生气喘。 消瘦 消瘦，贫血，有的牛肩前、股前、腹股沟、颌下、咽及颈淋巴结等体表淋巴结肿大。当纵膈淋巴结受侵害肿大，压迫食道，则有慢性胀气症状。病势恶化，可能发生全身性结核，即粟粒性结核。胸膜、腹膜发生结核病灶时呈现所谓的“珍珠病”，胸部听诊可听到摩擦音。,乳房感染 多数病牛乳房常被感染侵害，可见乳房上淋巴结肿大无热无痛，泌乳量减少，乳汁初期无变化，病重时呈水样稀薄。 顽固性下痢 肠道结核多见于犊牛，可表现为消化不良，食欲不振，顽固性下痢，迅速消瘦。,性机能紊乱 生殖器官结核可出现性机能紊乱，发情频繁且表现性欲亢进，慕雄狂与不孕。孕畜流产，公畜副睾及睾丸肿大，阴茎前部可发生结节、糜烂等。 神经症状 中枢神经系统主要是脑及脑膜发生结核病变，常引起神经症状，如癫痫样发作、运动障碍等。,禽型结核分枝杆菌感染 可能无临床症状，但亦可能出现昏睡和消瘦。在应激条件下，可能发生突然死亡，这往往与严重的肝脏病变有关，象这样的病变在死后解剖时容易观察到。 禽型结核分枝杆菌能引起人的一种渐进性的难以治疗的疾病。因此所有操作均须在有充分生物防护装置的条件下进行。,人型结核分枝杆菌感染 除灵长类动物会出现咳嗽等症状外，其他动物一般无明显临床症状。,人感染结核病的流行病学,3月24日是“世界防治结核病日”。 人的结核病主要由结核分枝杆菌引起感染，但人型和牛型结核杆菌对人均具有致病性。人体一般感染结核病后不一定发病，潜伏期长短不一，有的可以潜伏1020年，有的在三五年左右，也有短至几个月的。,人感染结核病的临床特征、病理变化,人常见于肺结核，呼吸道症状有咳嗽、咳痰，咳血或咯血。见有胸痛、胸闷或呼吸困难。咳痰量不多，但空洞时可多见，有时痰中有干酪样物，约1/31/2肺结核有痰血或咯血，多少不一。已稳定、痊愈者可因继发性支扩或钙化等导致咳血。一般肺结核无呼吸困难、大量胸水、自发气胸或慢性纤维空洞型肺结核及并发肺心、呼衰，心力衰竭者常有呼吸困难。全身症状常有低热、盗汗、消瘦、乏力，女性月经不调等。,病理变化,牛型结核分枝杆菌感染 病变可发生在所有内脏器管 最常见的是肺、胸膜、肠系膜淋巴结。 感染早期，可在肺门部位及肺门淋巴结见到干酪样坏死或钙化的病灶。 感染中后期，可在胸膜、胸腔见到“珍珠状”增生，形成所谓的“珍珠胸”。在肠系膜可见到串珠状淋巴结肿大。,禽型结核分枝杆菌感染 主要表现为肺、肝、脾的粟粒状结核病变，肝脾显著肿大，表面及组织内可见到大小似小米、颜色为灰黄色的化脓斑点。 人型结核分枝杆菌感染 可见干酪样坏死或钙化的病灶。 病变可发生在所有内脏器官，浆膜表面，特别是胸膜，骨及关节。 最常发生在肺、支气管、纵隔及咽喉淋巴结、乳腺、肝、脾及肠。早期的病变包括在咽喉、支气管纵隔，以及偶尔可见的肠系膜等淋巴结的干酪样及钙化肉芽肿，其大小从针尖大到榛实大，偶尔有蒂。 粟粒状结核病变的大小似小米，在肺、肝、脾以及其它器官可大量发现，其颜色为灰黄色。,组织病理变化,病理学特点 在器官组织发生以增生性或渗出性炎，或两者混合存在。 增生性结核结节 动物机体抵抗力强时，机体对结核菌的反应以细胞增生为主，形成增生性结核结节，由类上皮细胞，和巨噬细胞集结在结核菌周围，构成特异性肉芽肿，外围是一层密集的淋巴细胞和成纤维细胞，形成非特异性肉芽组织。器官原有轮廓被破坏。,渗出性结核 当机体抵抗力降低时，机体的反应则以渗出性炎为主，即在组织中有纤维蛋白和淋巴细胞的弥漫性沉积。后发生干酪样坏死，化脓或钙化，这种变化主要见于肺和淋巴结。渗出性结核的干酪样坏死保存了一般组织的结构，而在增生性病灶中。 需要指出的是 由上皮样及巨细胞组成的结节是不够作确诊结核病用的，因为该病变不是结论性的，尚需揭示出病原的存在。,诊断,1.临床症状和病理变化诊断 2.病原学诊断 抗酸染色法 、细菌分离培养法 3.免疫学试验牛的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验 4. 其它方法：PCR法、 迟发性变态反应试验 、 血清学方法、 淋巴细胞转化试验 、 -干扰素试验 、 菌体成分检测法,病理学诊断,在巨噬细胞内繁殖 结核杆菌侵入机体后，易被巨噬细胞吞噬，但在某些情况下不被杀死，而且能在巨噬细胞内繁殖并沿淋巴管蔓延。 原发性结节 局部病变主要是由该菌的直接作用形成特异性原发性病灶原发性结节。 当动物机体抵抗力强，则原发性病灶囊化，形成瘢痕或钙化而痊愈。 当动物抵抗力弱时，病菌可从淋巴、血管和天然管道三条途径散布全身，引起其他组织器官的结核病灶或全身性结核（粟粒性结核病）。,分枝杆菌培养鉴定,实验流程 1、染色镜检 确定是否是抗酸菌的培养阳性菌株 2、确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群还是NTM 首先经对硝基苯甲酸 (PNB)生长试验、28生长试验、耐热触酶试验、观察记录细菌的生长速度、菌落形态和菌落颜色确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群还是NTM。 3、确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群什么型 进行TCH生长试验、硝酸还原试验和烟酸试验进行菌种鉴定。 4、 属于NTM的菌株，确定属于快速生长还是缓慢生长的分枝杆菌。 快速生长的分枝杆菌可通过生长特征和生化实验进行菌种鉴定； 缓慢生长的分枝杆菌经色素产生试验确定菌株的产色特征后，再通过生长特征和生化试验确定菌株的种类。,病原分离及鉴定,病料 淋巴结 痰 乳 精液 子宫分泌物 尿和粪便,样品运送 样品应封装在无菌的容器内冷藏运送。 对那些提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性，但尸检时无病理学病变的动物，可从下颌、咽后、支气管、肺（特别是肺门及肺门淋巴结）、纵隔及一些肠系膜的淋巴结 采集样品送检。,样品处理,痰 牛咯痰极少，宜在清晨采集。 用硬橡胶管自口腔伸入至气管内，用注射器吸取痰液。亦可取牛咳出的痰块进行检验。 痰样品稀薄时，可加入等量的46硫酸处理，如痰样品粘稠时，则加入5倍量的4硫酸处理。充分摇匀后置37作用20分钟，以30004000rpm离心，沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。 也可用2倍量1520安替福民溶液处理痰液，将混合物置37作用12小时后离心。以灭菌生理盐水冲洗沉淀物几次后，取沉淀物染色镜检、培养和动物试验。 安替福民溶液 (溶液A：碳酸钠12g、漂白粉8g、蒸馏水80mL。溶液B：氢氧化钠15g、蒸馏水85mL。应用时A、B两液等量混合，再用蒸馏水稀释成1520后使用，该溶液须存放于棕色瓶内),样品处理,样品处理,乳 怀疑有乳房结核时。 一般以挤出之最后乳汁含菌量较多，早晨挤出的乳中含菌量最高。 将乳汁分置46支离心管中，每管10mL，以30004000rpm离心2030分钟，吸取上层乳脂和管底的沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。 乳汁10mL加1520安替福民溶液30mL，摇匀置37恒温箱内12小时，取出加等量灭菌蒸馏水混匀，离心沉淀后弃去上清，取沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。,样品处理,精液和子宫分泌物 有生殖道结核可疑时 采集公畜精液，母畜子宫分泌物进行细菌学检查。 处理子宫分泌物，可用1520安替福民溶液，混匀后静置23小时，30004000rmp离心20分钟，弃上清，加10mL蒸馏水于沉淀物中。即可作动物试验，经1.52个月剖检。,样品处理,尿 有肾结核可疑时 一般采集中段尿液，以早晨第一次尿为宜。 如仅作染色镜检，可将尿液以30004000rmp离心20分钟后，取沉淀物涂片。 如作培养或动物试验，则必须将尿液进行消化浓缩处理，再进行检验以免杂菌生长而影响检验结果。,样品处理,粪便 有肠结核可疑时 可采集粪便进行检查 患肺结核的牛只，有时在粪便中亦可检出结核分枝杆菌。因牛常将痰液吞咽至消化道内，随粪便排出。尽量采集混有粘液或脓血的粪便。 取粪便30g，加1520安替福民溶液15mL和蒸馏水55mL，混合，经23小时后，30004000rmp离心30分钟，倾去上清液，加10mL蒸馏水于沉淀物中，将此液用纱布过滤后接种于豚鼠皮下，经1.52个月后剖检。 或将粪便加2倍量灭菌蒸馏水磨碎，然后加氯化钠至饱和溶液。当液体中残渣沉淀后（液体完全澄清），浮起的薄膜含有大量的结核分枝杆菌。取出薄膜，用等量的4氢氧化钠（见附录D2）充分混合，置37中3小时，然后离心，取沉淀物用8盐酸中和后，即可作染色镜检、培养和动物试验。,样品处理,粪便中如有粘液或脓血，可挑取粘液脓血选用任何一种消化液处理后检验。 如系纯粪便，取510g，加生理盐水约34倍混合后，用细铜纱网过滤，取滤液置室温中自然沉淀，然后取上层悬液置于另一大离心管或烧杯内，加消化液约34倍量，置37温箱12小时，同上法处理后检验。,样品处理,组织器官： 尽量采集有结节病灶的部位。 病变组织需先研磨，制成乳剂 取组织乳剂或其它液状病料24mL，加入等量的5氢氧化钠溶液，充分振摇510分钟，或摇至发生液化为止，液化后经30004000rpm离心1530分钟，沉淀物加1滴酚红作指示剂，以2N盐酸中和至淡红色后，作染色镜检、培养和动物试验。 如病料为脓状或干酪状或钙化的结节病灶组织 可直接作染色镜检，往往可以检出众多的结核分枝杆菌，但若得到阴性结果，必须经浓缩处理后检验。,硫酸消化法,用46硫酸溶液将痰、尿、粪或病灶组织等按1:5之比例加入混合，然后置37作用12小时，经30004000rpm离心30分钟，弃上清，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。也可用硫酸消化浓缩后，在沉淀物中加入3氢氧化钠中和，然后抹片镜检、培养和接种动物。,氢氧化钠消化法,取氢氧化钠3540g，钾明矾2g，溴麝香草酚兰20mg（预先用60酒精配制成0.4浓度，应用时按比例加入），蒸馏水1000mL混合，即为氢氧化钠消化液。将被检的痰、尿、粪便或病灶组织按1:5的比例加入氢氧化钠消化液中，混匀后，37作用23小时，然后无菌滴加510盐酸溶液进行中和，使标本的pH调到6.8左右（此时显淡黄绿色），以30004000rpm离心1520分钟，弃上清，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。 在病料中加入等量的4氢氧化钠溶液，充分振摇510分钟，然后用3000rpm离心1520分钟，弃上清，加1滴酚红指示剂于沉淀物中，用2N盐酸中和至淡红色，然后取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。 在痰液或小脓块中加入等量的1氢氧化钠溶液，充分振摇15分钟，然后用3000rpm离心30分钟，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。 对痰液的消化浓缩也可采用以下较温和的处理方法：取1N（或4）氢氧化钠水溶液50mL，0.1mol/L柠檬酸钠50mL，N乙酰L半胱氨酸0.5g，混合。取痰一份，加上述溶液2份，作用2448小时，以3000rpm离心15分钟，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。,安替福民（Antiformin）沉淀浓缩法,将被检样品置于试管中 加入34倍量的1520安替福民溶液 充分摇匀后37作用1小时 加12倍量的灭菌蒸馏水，摇匀 30004000rpm离心2030分钟 弃上清沉淀物加蒸馏水恢复原量后再离心一次 取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。,病原检测,染色镜检 培养特性 动物试验 生化试验 分子生物学诊断,染色镜检,涂片 先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白， 甘油蛋白的配制：鸡蛋白20mL，甘油20mL，水杨酸钠0.4g，混匀。 如检验标本为乳汁等含脂肪较多的材料，在涂片制成后，用二甲苯或乙醚脱脂12分钟后倾去，再滴加95酒精以除去二甲苯，待酒精挥发后即可染色。 然后吸取标本滴加其上，涂布均匀。,萋尼氏抗酸染色,涂片后，经火焰固定 加石炭酸复红染色液 用100mL 95酒精加3g碱性复红配制成碱性复红饱和酒精溶液，取碱性复红饱和酒精溶液10mL，与5苯酚溶液90mL混合后用滤纸滤过 将玻片在火焰上加热至出现蒸汽（不能产生气泡），如此热染5分钟（如染色液干涸，须加适量补充）。 水洗后滴加3盐酸酒精脱色3060秒（至无色素脱下为止） 浓盐酸3mL，95酒精97mL，混匀。 水洗后，以骆氏美兰染色液复染1分钟。 甲液：美兰0.3g，95酒精30mL。乙液：0.01氢氧化钾溶液100mL。混合即成 水洗，吸干，镜检。 抗酸菌应不被盐酸酒精脱色而染成红色，其他细菌与动物细胞可被盐酸酒精脱色而均被染成兰色。,菌体形态,牛结核分枝杆菌呈细长平直或微弯曲的杆菌，长1.5-5微米，宽0.2-0.5微米. 在陈旧培养基上或干酪性淋巴结内的菌体，偶而可见长达10微米或更长,培养特性,配氏培养基 将马铃薯去皮225g擦成丝，加入马铃薯淀粉18g、天门冬素（或蛋白胨）2.6g、脱脂牛奶450ml，置烧杯中水浴煮沸4060分钟，并不时搅拌均匀，使成糊状。待冷却至50时加入除去了3个蛋清的打碎鸡蛋，混匀后用四层纱布过滤除渣。最后加入40g甘油和30ml 2%孔雀绿水溶液，搅拌均匀，分装于灭菌的试管中，置血清凝固器（或流通蒸汽锅）内，间歇灭菌3次，每天一次。第一天65灭菌30分钟。第二、三天7580灭菌30分钟。）,LJ培养基的配制 将磷酸二氢钾.24g、硫酸镁0.24g；枸橼酸镁0.6g、甘油12g和蒸馏水600ml混合后加热溶解。取马铃薯粉30g加入上述溶液内，随加随搅拌，水浴煮沸1小时。鸡蛋（约30个）用75酒精消毒外壳后，打开，将蛋清和蛋黄充分搅匀，4层纱布过滤。待上述加马铃薯粉的盐溶液冷却至50时，加入鸡蛋液1000ml和2%孔雀绿20ml，并充分搅匀。分装后80灭菌30分钟后，再37培养48小时，若无杂菌污染即可使用。 青霉素血液琼脂培养基的配制 1.5g将琼脂、1ml中性甘油及74ml蒸馏水混合，经103.4 Kpa 15分钟灭菌。待冷却到50时加入兔全血（或牛全血）25ml/青霉素（2000单位/ml）1.85ml，混合后分装，经37培养48小时，无杂菌污染即可使用。,培养,将经过处理的被检样品标本接种到培养基上（同时作24份）培养一天后，以熔化的石蜡封口，继续培养。 牛型结核分枝杆菌生长缓慢，初次分离培养时，需3637培养58周方可出现菌落。在固体培养基上不产生任何颜色，菌落湿润、略显粗糙并发脆。加1的丙酮酸钠能促进生长。若是非典型分枝杆菌，则生长较快，大部分（但不是全部）产生白色或具有橙色或黄色色素，常形成黄色或橙色菌落。某些种类的色素只有在亮处才显出。,牛型、禽型和人型结核分枝杆菌 鉴定,主要依据生化试验和动物试验。 生化试验：,牛型、禽型和人型结核分枝杆菌 鉴定,动物试验,动物试验,试验动物在试验前，应进行牛型提纯结核菌素和禽型提纯结核菌素皮内变态反应试验。 豚鼠和家兔对牛型结核分枝杆菌敏感，鸡对牛型结核分枝杆菌不敏感。 处理过的病料，皮下或肌肉、腹腔内注射 接种后30天左右，进行禽型提纯结核菌素和牛型提纯结核菌素皮内变态反应试验 如有阳性反应，可剖检其中的半数动物进行病理学观察、细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检观察。 如果为阴性反应，可于40天左右剖检其中的半数，观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检，另一半继续观察至3个月再剖检观察。,分子生物学诊断,DNA针 扩增从临床样品提取的靶序列，是来自热休克基因，大小为402碱基对(bp)片段，336bp和123bp为重复片段，或者单独插入对结核分枝杆菌特异的IS986、ISl081序列。 PCR 报道PCR能区别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。在实际应用中，需要进一步评价其特异性，特别是敏感性。 扩增片段可以看得见，可用生物素或地高辛代替同位素进行标记。,免疫学试验,结核菌素皮内变态反应试验 全血试验 淋巴细胞增生试验、干扰素试验 ELISA,牛提纯结核菌素皮内变态反应 试验,农业部关于2011年国家动物疫病监测计划要求，检测方法按照国家标准（GB/T 18645-2002），用牛提纯结核菌素皮内变态反应进行检测。,结核菌素皮内变态反应试验,用结核菌素进行的皮内变态反应试验是检查牛结核病主要方法。亦是OIE指定国际贸易用检测试验。试验分2种，一种是牛型结核菌素单一试验，仅用牛型提纯结核菌素进行，目的是检测是否存在牛型结核分枝杆菌的感染。另一种是结核菌素比较试验，用牛型提纯结核菌素和禽型提纯结核菌素同时进行，这是一种鉴别诊断试验，用以明确是牛型结核分枝杆菌感染，还是禽型或副结核分枝杆菌或其他分枝杆菌感染。,c) 注射方法 先以75酒精消毒术部，然后皮内注射定量的牛型提纯结核菌素，注射后局部应出现小胞，如对注射有疑问时，应另选15cm以外的部位或对侧重作。 d) 注射次数和观察反应 皮内注射后经72小时判定，仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量皮皱厚度，作好详细记录。 对疑似反应牛应立即在另一侧以同一批提纯结核菌素同一剂量进行第二回皮内注射，再经72小时观察反应结果。 对阴性牛和疑似反应牛，于注射后96和120小时再分别观察一次，以防个别牛出现较晚的迟发型变态反应。,牛型提纯结核菌素皮内变态反应 试验,出生后20天的牛即可用本试验进行检疫。 操作方法如下： a) 注射部位及术前处理：将牛只编号后在颈侧中部上1/3处剪毛（或提前一天剃毛），三个月以内的犊牛，也可在肩胛部进行，直径约10cm。用卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好记录。注意，术部应无明显的病变。 b) 注射剂量：不论大小牛只，一律皮内注射0.1mL（所含单位20005000IU）。冻干提纯结核菌素稀释后当天用完。,结果判定 a) 阳性反应： 局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0 mm 。 b) 疑似反应： 局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0 mm，同时小于4.0 mm 。 c) 阴性反应： 无炎性反应。皮厚差在2.0 mm以下。 凡判定为疑似反应牛，于第一次检疫60天后进行复检，其结果仍为疑似反应时，经60天再复检，如仍为疑似反应，应判为阳性。,皮内变态反应比较试验,本试验采用牛型提纯结核菌素和禽型提纯结核菌素同时进行。 操作方法： 在牛颈中部选2个点，一个在上1/3处一个在下1/3处。2个点之间的距离不得少于10cm。注射点及周围的皮肤应无异常。 禽型提纯结核菌素的注射剂量为每头0.1ml，含0.25万IU。即将禽型提纯结核菌素稀释成每毫升含2.5万IU后，皮内注射0.1毫升。 牛型提纯结核菌素的注射剂量为每头0.1ml，含0.200.5万IU。即将牛型提纯结核菌素稀释成每毫升含2.05.0万IU后，皮内注射0.1毫升。,结果判定 a)牛型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性。 对牛型提纯结核菌素的反应为阳性（局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0 mm），并且对牛型提纯结核菌素的反应大于对禽型提纯结核菌素的反应，二者皮差在2.0 mm以上，判为阳性。 对已经定性为牛型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0 mm以下，甚至对牛型提纯结核菌素的反应略小于对禽型提纯结核菌素的反应（反应差小于或等于2.0 mm），只要对牛型提纯结核菌素的反应在2.0 mm以上，也应判定为牛型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性牛。,b)禽型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性。 对禽型提纯结核菌素的反应大于对牛型提纯结核菌素的反应，两者的皮差在2.0 mm以上，判为禽型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性。 对已经定性为副结核分枝杆菌或禽型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0 mm以下，甚至对禽型提纯结核菌素的反应略小于对牛型提纯结核菌素的反应（不超过2.0 mm），只要对禽型提纯结核菌素的反应在2.0 mm以上，也应判为禽型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性牛。,全血试验,除了传统的结核菌素试验方法外，现有了一些新的血液诊断试验方法。 淋巴细胞增生试验 原理 测定全血样品中致敏淋巴细胞对结核菌素PPD抗原的细胞反应性。 这种试验具有科学价值，但在常规诊断中并不采用，因为试验耗时，而且前期准备以及试验操作都比较复杂(需要较长的孵育期，并使用放射性核甙酸)。 然而，这种试验可用于野生动物以及动物园动物的检测,r干扰素试验 本试验是测定全血培养系统中淋巴因子的释放 原理 有特异性抗原(PPD-结核菌素)培育1624小时培育期间内，致敏淋巴细胞释放出r干扰素。 用对牛r干扰素的两种MAb，作夹心ELISA法。 单抗1 单抗1+干扰素 单抗1+干扰素+单抗2,r干扰素试验 其敏感性和特异性 可与结核菌素皮试相当。 方便 对于很难接触或接触有危险的动物，如有恶习的或其它牛科动物，这种方法较皮试优越之处在于只需抓捕一次动物， 成本高 样品不能存放 收集血样后试验必须在8小时内进行。 此外，这种方法仅适用于牛科动物。,ELISA,补充试验 可作为细胞免疫试验的补充，但不能取而代之。 它有助于检测无变态反应的牛，比如感染初期，活动期结核。 ELISA的优点 简便 与Y一干扰素试验的理由一样，ELISA也适用于检测野生动物和动物园动物的牛分枝杆菌感染 可揭示细胞免疫反应弱的感染动物。 特异性、敏感性 但其特异性和敏感性需要使用不同抗原来提高，包括蛋白质(例如非常特异的MPB70)和(