微生物发酵床猪舍环境气味电子鼻判别模型的研究.doc

微生物发酵床猪舍环境气味电子鼻判别模型的研究发酵床养猪技术是近年来发展起来的粪污原位降解的生态养猪方法，是依据生态学原理，利用益生菌资源，将微生物技术、发酵技术以及养殖技术相结合起来应用于现代养殖业，从而控制畜禽粪便排放，减少环境污染，是一种环保养殖模式。这是一种倡导慎重开发利用资源、废弃物资源化、清洁生产、遵循自然生态系统的物质良性循环规律的经济发展模式，是一个“资源产品再生资源”的闭环反馈式循环过程（刘波等）。发酵床普遍采用的原料是谷壳和锯末，是一个复杂的体系，在发酵床微生物变化（刘波等，2008；郑雪芳 等）、气味控制（Groenestein C M，1996）、培养基调控（Morrison R S，2003）、营养元素分解（Chan D K O.，1994）等方面，已有学者进行了研究。目前形成的一些实际管理技术多出于管理者实际操作积累的经验（金文英，2011；李骁驽，2010；王晓飞 等，2010），许多技术缺乏明确的研究指标。发酵床通过微生物发酵使猪排泄的粪尿分解，垫料也在发酵腐熟的过程中不断消耗，使猪的排泄物与垫料的处理能力达到平衡对发酵床养猪显得非常关键（WIRTH H，1983）。如何简单科学的判定垫料的发酵程度，采用相应的技术处置措施，使垫料的发酵处在最佳水平，使用寿命最长，亟需深入研究。电子鼻概念最早是1982年由英国 Warwick大学的Persand和Dodd教授研究模仿哺乳动物嗅觉系统的结构和机理，对几种有机挥发气体进行判别分析时提出的（K. Persand et al.,1982）。与普通的化学仪器，如色谱仪、光谱仪等不同，得到是样品中挥发成分的整体信息；在食品品质监控（Blixt Y et al.,1999；洪雪珍 等，2011）、粮食储藏（Evans P et al.,2000；周显青 等，2010）、医学诊断（Turner APF et al,2004；何庆华 等，2010）、环境保护（杨建华 等，2002；毕丽君 等，2006）等方面广泛应用。本研究利用气象色谱-质谱联用技术分析不同发酵状态垫料的挥发性物质组成，提出微生物发酵床猪舍环境气味电子鼻判别模型，旨在通过对不同发酵程度垫料的挥发性物质的分析，建立一套垫料发酵程度判别方法，科学指导实际生产。1材料与方法1.1 供试材料 样品为养猪发酵床垫料，使用时间为3-5个月。采集时间：2010年8月17日。采集地点：福州新店部队生猪养殖场。采集方法：猪栏面积为68m，在猪栏纵向中轴线上距采食台1m、3m、5m处设3个样点，每个采样点直径约40cm，将垫料上下翻匀，取样待用，共30个样品。1.2实验仪器主要实验仪器采用美国Agilent公司制造的7890A/5975C气质联用仪（GC/MSD）；SPME萃取柄（美国Supleco公司），100m聚二甲基硅氧烷（PDMS）萃取头（美国Supleco公司）；电子天平（Navigator NO4120）；恒温摇床（HZQ-F160）；pH计。1.3实验方法1.3.1发酵床垫料气味气体收集方法SPME老化方法：使用前将SPME萃取头旋入萃取柄，用丙酮浸泡萃取头1 h后，将SPME萃取头在气质联用仪的进样口250 老化30 min。挥发性气味收集，将发酵床垫料样品100g放置于250ml三角瓶内，有孔橡皮塞封口，用封口膜将橡皮塞孔封住，室温（32左右）放置24小时。插入SPME的萃取柄，采集时间为3h。1.3.2 发酵床垫料气味GC-MS分析进样方式：手动进样。色谱条件：采用HP5-MS色谱柱，进样口温度250 ，压力4.5338 psi，总流量104 mL/min，隔垫吹扫流量3 mL/min，不分流。升温程序为：50 保持2 min，以5 /min上升到280 保持3 min。质谱条件：采集模式：全扫描；EMV模式：相对值；全扫描参数：开始时候的质量数50.00 amu，结束时的质量数550.00 mu；MS温度：离子源230 ，MS四级杆150 。1.3.3发酵床垫料气味类别的聚类分析以采样的顺序为样本，样品中的物质含量为指标，数据矩阵进行规格化处理，以马氏距离为尺度，用可变类平均法对数据进行系统聚类分析。1.3.4发酵床垫料气味判别模型的建立以各物质在样品中含量（Xj）为指标，各部位样品（Xi）为样本，垫料发酵级别（Y）为测定值，以组建判别分析数据矩阵如下：X11 X12 X1j Y1X21 X22 X2j Y2 Xi1 Xi2 Xij Yi 其中，j为Nacl的浓度序号，i为垫料发酵程度级别序号。用 Bayes 逐步判别方法建模，多组逐步判别分析是按照 Bayes 准则，用WILKS 统计量从 M个因子中，根据各因子判别能力大小的显著性检验结果，精选出若干判别能力大的且配合较好的因子，建立 Bayes 判别函数。并可判别新的样本是属于哪一组。Bayes 判别函数方程：其中：当，将个体x划入第i类。判别值的后验概率为：聚类分析、主成分分析、判别分析采用DPS 数据处理系统进行计算。2结果与分析2.1发酵床垫料气味物质分析检测的挥发性物质结果见表2。匹配度90，相对含量4%，共检测到26个物质。表2挥发性物质（匹配度90，相对含量4%）CA号加入，匹配度90，相对含量4%编号名称中文名分子式11,2,4-Benzenetricarboxylic acid,-dodecyl dimethyl ester21H-3a,7-Methanoazulene,2,3,4,7,8,8a-hexahydro-3,6,8,8-tetramethyl-, 3R-(3.alpha.,3a.beta.,7.beta.,8a.alpha.)-3R-(3,3A,7,8A)-2,3,4,7,8,8A-六氢-3,6,8,8-四甲基-1H-3A,7-亚甲基奥alpha-柏木烯C17H2431-Octadecene十八烯C18H3642,6-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-(1-oxopropyl)phenolC17H26O254-(3-Oxocyclohexyl)butyric acid,methyl ester6Benzoic acid, 2,5-bis (trimethylsiloxy)-, trimethylsilyl esterC16H30O4Si37Butylated Hydroxytoluene二丁基羟基甲苯C15H24O8Cyclodecasiloxane, eicosamethyl-C20H60O10Si109Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl-C14H42O7Si710Cyclopentanepropanoi acid,2-methyl-3-oxo-,methyl ester, trans-(.+ -.)-11Eicosane二十碳烷C20H4212Heneicosane二十一烷C21H4413Heptacosane二十七烷C27H5614Heptasiloxane, hexadecamethyl-C16H48O6Si715Hexacosane正二十六碳烷C26H5416Hexadecane十六烷C16H3417meso-4,5-Dicyclohexyl-2,7-dimethyloctan18n-Nonadecanoic acid,pentamethyldisilyl ester19Nonacosane二十九烷C29H6020Octacosane二十八碳烷C28H5821Octadecane十八烷C18H3822Pentacosane二十五烷C25H5223Phenol,2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4- (1-methylpropyl)-6-溴吲哚-3-甲醛C18H30O24Piperidine, 1-(5-trifluoromethyl-2-pyridyl)-4- (1H-pyrrol-1-yl)-25Tetracosane二十四烷C24H5026Thiophene, 2-decyl-C14H24S2.2发酵床气味物质在样品中分布的多态性分析各物质在样品中含量见表3。以各物质在各部位样品中含量为指标，以马氏距离为尺度，用最长距离法对数据进行系统聚类分析，结果见表3和图1，当=26.01时，可将这些物质分为3类。类别包括9种物质，其中Butylated Hydroxytoluene（二丁基羟基甲苯）在25个样品中分布，平均含量为36%；1H-3a,7-Methanoazulene,2,3,4,7,8,8a-hexahydro-3,6,8,8-tetramethyl-,3R- (3.alpha.,3a.beta.,7. beta.,8a.alpha.)-（3R-(3,3A,7,8A)- 2,3,4,7,8,8A-六氢-3,6,8,8-四甲基-1H-3A,7-亚甲基奥alpha-柏木烯）在2个样品中分布，含量均为5.32%；1,2,4-Benzenetricarboxylic acid,-dodecyl dimethyl ester、1-Octadecene（十八烯）、2,6-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-(1-oxopropyl) phenol、4-(3-Oxocyclohexyl) butyric acid,methyl ester、Benzoic acid, 2,5-bis (trimethylsiloxy)-, trimethylsilyl ester、Cyclodecasiloxane, eicosamethyl-和Cyclopentanepropanoic acid,2-methyl- 3-oxo-,methyl ester, trans-(.+ -.)-共7种物质仅在1个样品中分布，含量为5.32%15.3%。类别包括11种物质，其中Heneicosane（二十一烷）、Hexadecane（十六烷）、meso-4,5- Dicyclohexyl- 2,7-dimethyloctan、n-Nonadecanoic acid,pentamethyldisilyl ester、Octadecane（十八烷）和Piperidine, 1-(5-trifluoromethyl- 2-pyridyl)-4- (1H-pyrrol-1-yl)-这6种物质仅在一个样品中出现，含量在4%10%之间。Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl-在2个样品中出现，含量在4%8%之间；Hexacosane（正二十六碳烷）在7个样品中出现，含量在4.04%13.71%之间；Eicosane（二十碳烷）存在于7个样品中，含量为6.56%27.46%；Heptacosane（二十七烷）在4个样品中出现，含量为5.5%16.53%；Heptasiloxane, hexadecamethyl-在2个样品中出现，含量分别为18.98%和23.11%。类别包括6种物质，其中Nonacosane（二十九烷）和Pentacosane（二十五烷）在三个样品中存在，含量为4.01%45.51%；Octacosane（二十八碳烷）、Phenol,2,6-bis(1,1- dimethylethyl)-4- (1-methylpropyl)-（6-溴吲哚-3-甲醛）、Tetracosane（二十四烷）和Thiophene, 2-decyl-共4种物质仅存在于1个样品中，含量分别为13.6%、6.94%、10%和6.37%。表4 聚类过程TIJ距离物质124121.842862.283432.5241792.65521183.17616113.557653.65823204.46918155.081026255.821114136.3612217.07131077.521420197.66151598.991622199.1217759.5318319.8419131111.2420121115.15215116.752211921.1023251923.472419933.42图1 系统聚类图259143.35表3 挥发性物质在样品中含量（匹配度90，相对含量4%）编号样本类别物质含量123456789101112131415161718192021222324252611-1105.3200005.65000000000000000000021-2100000025.4700011.570006.550000000000031-3100000024.03000000000000000000042-1100000012.34000000000000000000052-216.060000058.16000000000000000000062-310006.34011.3000000018.9800000000000074-110020.500022.90000000000000000000125-3100000021.7900000000000000000002314-21000000000000000007.170000000094-3200000013.1600027.46016.530000045.150000040105-1200000049.620008.97000005.06000000000115-22000000000000023.11000000009.59000146-2200000063.170009.1405.504.04000000000001912-1200000031.1500012.110105.520000004.0100002012-2205.32000050.65000000000000000000084-23000000700000000000000000000136-13000015.3000000000000000000000156-3300000043.9200017.85010.1508.060000006.030000168-1300000020.056.724.9706.567.37000000000001000178-230000006.72000900013.710008.2513.06000000188-3300000013.0607.960000008.5200000000002112-3300000040.58005.5715.510000000006.94000002414-330000000000000000042.62000000002715-3300000071.5100000000000000000002816-1300000060.7300000000000000000002214-1400000070.760000000000000000006.372515-1400000021.6700013.61014.72011.670009.82007.2900002615-2400000058.80000000000000000007.092916-2400000043.600021.730007.780000005.7600003016-340000005.34000000000064.51000000002.3发酵床样品聚类分析试验结果见表4和图2。当=23.59时，可将这些样品分为4类。类别包括9个样品1、2、3、4、5、6、7、12和23。类别包括6个样品9、10、11、14、19和20。类别包括10个样品8、13、15、16、18、17、21、24、27和28。类别包括5个样品22、25、26、29和30。表4 聚类过程TIJ距离样品1431.12219101.7132782.46418152.74524162.8962373.62714113.8681234.30921174.481026255.761120105.921216136.4213216.5614767.091517158.191628158.82171098.851829228.951911910.06206510.14213111.052213812.6423302215.54245116.1225252220.672615823.59279131.022822839.16图1 系统聚类图298158.432.4判别分析以各种物质在样品中的含量（Xj）为指标，各样品的（Xi）为样本，垫料发酵级别（Y）为测定值，以组建判别分析数据矩阵如表3。当Fa临界值=0.10时，各个因子分类均值见表5，计算结果建立的判别模型如下：Y1= -7.15+1.61X1+2.01X2+0.70X3+0.83X4+0.60X5+0.13X7+0.94X9+3.82X10-1.12X11+2.35X12- 0.37X13+3.87X15+1.77X17+0.20X18-0.61X19-1.66X20-0.57X22+0.95X 23+17.92X25+0.77X26 Y2=-4.92-1.08X1+0.72X2+0.03X3+2.24X4+0.60X5+0.20X7+0.82X9+5.07X10-1.76X11+1.18X12- 0.34X13+3.24X15+3.93X17+0.25X18-2.59X19-0.25X20+2.40X22+0.95X23+44.41X25-0.89 X26 Y3=-10.75-1.27X1+1.04X2+0.12X3+1.44X4+1.58X5+0.29X7+2.55X9-3.55X10+2.07X11-3.11X12+ 0.31X13-3.47X15-4.70X17+0.32X18+1.97X19+1.52X20-1.19X22+2.51X23-32.62X25-0.36X26 Y4=-16.48-1.64X1+2.72X2+0.14X3+2.18X4+1.19X5+0.37X7+1.69X9+7.27X10-2.40X11+1.54X12+ 0.72X13+4.16X15+3.38X17+0.67X18-4.98X19+1.11X20+3.52X22+1.90X23+72.99X25-1.34X26 计算后分类和后验概率见表7，判别效果矩阵分析见表8。对于30个样本发酵级别的判别，错误4个，分别是样品5，原分类类，模型判别为类；样品15原分为类，模型判别为类；样品25原分为类，模型判别为类；样品29原分为类，模型判别为类。模型对垫料发酵程度级别的判别准确率达86.7%，精确度可以满足垫料发酵程度归类。表5 各个因子分类均值类别 X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 X25 X26 第1类 0.67 0.59 2.28 0.00 0.00 0.00 26.80 0.75 0.55 0.00 4.53 0.82 1.64 0.00 3.55 0.00 0.00 0.00 2.01 1.45 0.00 0.81 0.00 1.11 0.00 0.79 第2类 0.00 0.00 0.00 1.06 0.00 1.88 27.19 0.00 0.00 0.00 3.51 0.00 0.17 3.16 0.92 0.00 0.84 1.20 0.00 0.00 0.00 0.67 0.00 0.00 0.00 0.00 第3类 0.00 0.00 0.00 0.00 1.53 0.00 33.99 0.00 0.80 0.56 7.38 0.00 2.20 2.31 1.18 0.85 0.00 0.00 4.52 0.00 0.69 0.58 0.96 0.00 0.40 0.64 第4类 0.00 1.06 0.00 0.00 0.00 0.00 32.13 0.00 0.00 0.00 3.57 0.00 2.03 0.00 1.61 0.00 0.00 21.43 0.00 0.00 0.00 1.21 0.00 0.00 0.00 0.00 总 的 0.20 0.35 0.68 0.21 0.51 0.38 30.16 0.22 0.43 0.19 5.12 0.25 1.60 1.40 1.91 0.28 0.17 3.81 2.11 0.44 0.23 0.77 0.32 0.33 0.13 0.45 表6 判别模型的建立x(0) x(1) x(2) x(3) x(4) x(5) x(7) x(9) x(10) x(11) x(12) x(13) x(15) x(17) x(18) x(19) x(20) x(22) x(23) x(25) x(26) -7.15 1.61 2.01 0.70 0.83 0.60 0.13 0.94 3.82 -1.12 2.35 -0.37 3.87 1.77 0.20 -0.61 -1.66 -0.57 0.95 17.92 0.77 -4.92 -1.08 0.72 0.03 2.24 0.60 0.20 0.82 5.07 -1.76 1.18 -0.34 3.24 3.93 0.25 -2.59 -0.25 2.40 0.95 44.41 -0.89 -10.75 -1.27 1.04 0.12 1.44 1.58 0.29 2.55 -3.55 2.07 -3.11 0.31 -3.47 -4.70 0.32 1.97 1.52 -1.19 2.51 -32.62 -0.36 -16.48 -1.64 2.72 0.14 2.18 1.19 0.37 1.69 7.27 -2.40 1.54 0.72 4.16 3.38 0.67 -4.98 1.11 3.52 1.90 72.99 -1.34 表7计算后分类和后验概率样本序号原分类计算后分类后验概率1110.982111.003111.004111.00512*0.946111.007111.008111.009110.8710220.9311221.0012220.8913221.0014220.971523*0.5516331.0017330.6818331.0019331.0020331.0021331.0022331.0023330.5524331.002532*0.9426440.9927441.0028441.002942*0.4830441.00表8判别效果矩阵分析来自判为类1类2类3类4小计正确率%类1810090.89类2051060.83类30190100.90类4010450.80判对的概率=0.866673讨论发酵床的主要功能是使猪排泄的粪尿原位发酵分解，垫料管理的核心是使猪的排泄物与垫料的处理能力达到平衡。管理的好坏不仅关系到垫料使用的年限，而且会影响猪群的健康状况和饲养效果（王兆勇，2009）。不同发酵状态的垫料其