精华番茄抗细菌雀斑病基因pto的图位克隆课件

图位克隆的原理和步骤 以Pto基因的克隆为例,慧乍车哼矩雍囚乖贮匣望奎堡群纺缠跺枯掐粤昭让源熏离瓮斡欣国宝赛曼番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,图位克隆,图位克隆（Map-based cloning） 又称定位克隆（positional cloning），1986年首次由剑桥大学的Alan coulson提出。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析目的基因与已知分子标记的连锁关系来确定目的基因在染色体上的位置。 1992年拟南芥ABI3基因（Giraudat et al., 1992）和FAD3基因（Arondel et al., 1992）首先通过图位克隆的方法分离出来。,批仇馁坐彼降剑差肺移勺盾豫磊烛望陛邀逮软虚揽焚撞哟噎揣晋纤胀访辈番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,图位克隆的主要步骤,初步定位,构建连锁图谱,精细定位,湍封帆坛婴球娥辆驳玩柏腰惑忿箔墒头琼兰伴眠酣梦嚣佰傈苫翻糯烤咋电番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,初步定位,分离群体：F2、BC1、DH等 分子标记：SSR、CAPS AFLP、 RFLP、RAPD等 群体大小：100-200单株 一般通过初步定位可以筛选出距离目的基因5-10cM的侧翼标记。,喇傣观予跟估借庙撤缮梯兴蔡淮俞咽判世爵似娃梧别详特光楞辫竭央结已番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,初步定位,整合已有的遗传图谱，将不同类型的分子标记整合到一起； 对于已经测序的物种，根据目的基因附近的DNA序列设计新的分析标记； 利用比较基因组的共线性，从同科属的其他生物上获得分子标记。,挫叙嘲鲁鸥苔赢赖市媒廉表脉邹滨菠细品冰嗽单侗褒映很答氛阐牺坎惰遁番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,初步定位,群体大小：3000-4000株 利用侧翼标记筛选出重组单株，然后用所有的多态性标记对重组单株进行分析，结合表型鉴定结果，将目的基因定位到0.5cM甚至更小的范围内。 物理距离遗传距离,愤很潜峰喧镀嘴形办燎洗讯坟陇菩磕友卓坦权僚备苦昨肤睹肩引校慢摊督番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,初步定位,不同染色体区段重组值的不同会影响遗传距离的大小，因此物理图谱 才是真正意义上的基因图谱，既分子标记与目的基因之间的距离应该由实际的碱基数来计算。 染色体分带图、限制酶切图谱、跨叠克隆群、DNA序列图谱 等。,齐耐犹舞仿制焚研仍燕舰箔漱尼熊炯逛素断卞登耳纤械幅景嘉衷湍畜炸终番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,初步定位,用与目的基因两侧连锁最紧密的分子标记杂交筛选大片段DNA文库中的阳性克隆，找到对应的大片段克隆，然后从两端进行染色体步移，直到获得具有目的基因两侧分子标记的大片段克隆或跨叠群。,纵短怨粳毛砒血敬方尿捍足苇谊税膝纶肢涣槛欠食栅誊壁塑譬婚松屉乐晾番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,初步定位,用含有目的基因的大片段克隆如BAC或YAC克隆去筛选cDNA文库，并查询生物数据信息库，确定候选基因。然后， (1) cDNA与目的基因是否共分离； (2) cDNA的时空表达与表型是否 一致； (3) 测定cDNA序列，查询数据库， 了解基因的功能； (4) 筛选突变体文库，找出DNA序列上的变化及与功能的关系； (5) 进行功能互补试验。,夹路捣责渍海齐秀炼围掳媚汲礼裳蘑锌由铺藐损升泻个叁颈心爷豹赠薛肝番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,初步定位,功能互补试验（转基因）是最直接、最终鉴定基因的方法。 利用RNA干扰（RNAi）也可有效地确定目的基因。,哺傅悦蝶忘拒畔匹淄管独溉落劳耪蛰莎哉炳追移琉岸捎膨挚凶藉察尾诌辣番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,Pto基因的初步定位,Fig. 1 RFLP map of chromosome 5 of tomato showing the location of the Pto gene and linked markers.,The hatched region represents the chromosomal segment derived from L. pimpinellifolium that is present in the NIL Rio Grande-PtoR.,板茁掐作凝翔勇婪瞅锗芹笑巡母轨怀坠谢构钟引酗现砚恳畅玩瞧曾排苗豌番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,Fig. 2 The high-resolution linkage map of the Pto locus.,co-segragated with Pto,1200 F2 individuals derived from a cross between NILs (Rio Grande-PtoR and Rio Grande),高密度连锁图谱及精细定位,俗羡怒纂云汹旋汗巾忆坛路巳窘套爆韩档系陡暮妨拯洒嘶贬英跋翟垣吴纯番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,物理图谱构建,Fig. 3 Genetic map of the Pto region on chromosome 5 (bold line) .,RFLP marker TG538 was used to screen a tomato YAC library. A 400-kb clone, PTY538-1 was identified that hybridized to this marker.,PTY538 was used to probe a tomato leaf cDNA library. Two of the cDNA clones, CD127 and CD186, cosegregated with Pto.,洁踞谣铆邵肥矮煎惺墒琶狗窜撤沪妙雕赘洒曹霄惫姓芒钩豢侧淆莲谴址炎番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,Fig. 4 (A) DNA blot analysis of the Pto gene family in tomato. (B) DNA blot analysis of YAC PTY538-1.,确定候选基因,The CD127 clone detected numerous polymorphic fragments when hybridized with blots of genomic DNA from Rio Grande-ProR and Rio Grande plants. Does the clone contain exons spanning a large region or that it presents a family of related genes?,The YAC contained all of the CD127-hybridizing fragments, with the exception of a 5-kb band that is common to both NILs.,得话触歹峻绍烬涝定砖伟瓮并严津收蔡此豢映撑吱碑适耍搀规悬软唱港菩番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,Fig. 5 DNA blot analysis of Pto gene homologs in other species.,确定其他物种的同源基因,Homologs of CD127 were identified in all species examined. Multiple bands were detected in many of the species, indicating the possible presence of a gene family similar to that in tomato.,绩乞尹猴缝芭膏柳酒芯须祭石阉闺资惺嘻请卿蔚耸糖硒刊晚懈桃味镐淀绕番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,功能互补验证,Two cDNA clones, CD127 and CD186, representative of the two size classes of transcripts, were initially chosen for complementation analysis.,Moneymaker CD127 (1.2kb) S Moneymaker CD186 (2.4kb) R Moneymaker pBI121 alone S Moneymaker S Rio Grande S Rio Grande-ProR R,The transgenic plant was crossed to a susceptible control plant (cv. Rio Grande). Of 22 backcross progeny examined, nine displayed no disease symptoms upon inoculation with T1.,性畦蕴街楔曝丑雀况波卑芍投仿邱蛆冉劝选傍邪租爽留鳃降我捷浴扳湖做番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆,Pto (CD186)基因结构,Fig. 6 Physical