《理学基因工程》PPT课件.ppt

现代生物技术,主讲教师：李远,生物技术绪论,生物技术是指人们以现代生命科学为基础结合其他基础学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的 生物技术包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程,第一章 基因工程,一、概述 基因工程的应用 制药业（胰岛素、生长素） 转基因食品 其他（转紫罗兰基因） 基因工程的优点 可以大量生产人们急需的蛋白、激素等制剂 转基因农作物产量高（？）、使用农药少 基因工程的缺点 转基因食品的安全性有待进一步研究；基因污染的问题,二、基因工程的诞生,1.1868年，瑞士科学家米歇尔(F. Miescher),从绷带的脓细胞中分离出细胞核，再从细胞核中得到了一种含磷很多的化合物，称它为核素，即现在的核蛋白。 2.理论上的三大发现 1934年, O. T. Avery研究了肺炎双球菌 (Diplococcus pneumoniae)的转化 ，证明了DNA是生命的遗传物质; DNA可以把一个细菌的性状转给另一个细菌 1953年，Waston和Crick发现DNA的双螺旋结构 1961年，J. Monod 和F. Jacob提出操纵子学说；Nireberg确定遗传信息以密码方式传递，3个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，1966年破译64个密码，叙述中心法则,三、基因工程的定义,1. 基因工程的定义 将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作 基因工程实施的4个条件： 工具酶，基因，载体，受体细胞（工具酶、载体、逆转录酶被称为基因技术上的3大发明）,四、基因工程的分子生物学基础,1. 核酸的组成与结构 核酸分为RNA（核糖核酸）和DNA（脱氧核糖核酸），RNA又分为mRNA、tRNA、rRNA 1.1 DNA的一级结构 单链DNA是由一系列的单核苷酸组成的，其结构为：磷酸脱氧核糖（戊糖）碱基 其中碱基主要是嘌呤和嘧啶2类，根据碱基的不同可以分为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)，尿嘧啶（U）图,1.2 DNA的二级结构,DNA的二级结构较多，其中Waton-Crick提出DNA的双螺旋结构，其理论要点是： 两链平行反向且右旋 碱基以氢键互补配对，A-T, G-C 螺旋每周含10个碱基对，一周升高340nm，直径200nm 磷酸核糖主链在螺旋外侧，碱基对平面在内侧且与主链垂直 ，图,DNA又可分为右手螺旋DNA和左手螺旋DNA 右手螺旋DNA：A-DNA ,B-DNA, C-DNA，它们的每周螺旋碱基对数目、螺距、碱基倾角不同，Waton-Crick提出DNA的双螺旋结构是B-DNA，此类DNA碱基倾角为0。 左手螺旋DNA（Z-DNA）：鸟嘌呤为顺式，磷原子走势为之字形，图 1.3DNA的三级结构 除直线以外的其它三级结构：三股DNA，超螺旋结构，发夹形，环状双链DNA，图,2.DNA的复制,DNA的复制是一个及其复杂的过程，它是由多种酶和蛋白因子协同完成的，其复制的过程为： 从特定位点（复制起点）开始复制，在此位置双链DNA解螺旋，形成复制叉 半保留复制 DNA的两条链各自作为新链合成的模板。复制后的DNA有一条亲链和一条新合成的DNA链 复制方向由35 DNA复制具有高度忠实性 DNA聚合酶具有自我校正功能 （半不连续复制 ） DNA聚合酶；DNA松弛酶；DNA解螺旋酶；单链结合蛋白（SSB）；引物等 ，图,3. 基因的表达,DNA碱基中所包含的遗传信息最终以合成蛋白质的形式表达出来，目前科学家已经破译了遗传密码，图 DNA中的基因信息并不能直接表达为蛋白质，首先它需要把遗传信息转移到信使RNA（mRNA）中，与DNA复制不同的是转录过程中，DNA只有一条核苷酸链上的一部分基因被转录，图 新转录出的RNA需要经过校对,并将不表达蛋白的基因序列切除掉,从而保证翻译蛋白过程的连续性,蛋白质的翻译过程是在细胞质的核糖体中进行的，参与翻译的2种RNA分别是mRNA和tRNA（转运RNA）图 4.遗传信息的传递方向中心法则 DNA通过自身为模板进行复制使遗传信息代代相传，并通过RNA最终将遗传信息传给蛋白质分子，图 逆转录酶的发现是对中心法则的补充 原核生物与真核生物在基因表达时的区别,五、基因工程的内容,基因工程的内容包括 带有目的基因的DNA片断的提取 在体外将带有目的基因的DNA片断连接到载体上，形成重组DNA分子 重组DNA分子导入受体细胞 带有重组体的细胞扩增，获得大量细胞繁殖群体 重组体的筛选,5.1 目的基因的提取与扩增,5.1.1 目的基因的提取 目的基因的提取主要依靠使用工具酶来完成的，其主要分为三大类：限制性内切酶，连接酶，修饰酶 限制性内切酶 对DNA具有碱基专一性的内切酶：降解外源的，未经特殊修饰的DNA。不降解自身细胞的DNA（位点上甲基化修饰） 分类： I类和 III类：随机切割，很难形成稳定特异性切割末端。基本不用 II类限制性内切酶：识别特定的核苷酸序列，识别的DNA长度一般为4，5，6；具有特定酶切位点,限制性内切酶切割DNA的位点 DNA在限制性内切酶的作用下，使多核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点 限制性内切酶只作用于具有特殊的序列的DNA位点，如，回文结构，图 有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子后所得到的DNA片断具有相同的黏性末端，称这样的一组限制性内切酶为同尾 酶，如T|CGA、AT|CGAT、GT|CGAC均产生5CG末端,DNA连接酶 DNA连接酶能催化双链DNA片断紧靠在一起的3OH末端与5P末端之间形成磷酸二酯键，常用的DNA连接酶有： E.coli DNA连接酶：此连接酶只能催化双链DNA互补黏性末端之间的连接，不能催化平末端的之间的连接 T4 DNA连接酶：既可以催化双链DNA互补黏性末端之间的连接，又可以催化平末端的之间的连接,修饰酶 待连接的两个DNA片断经过切割后未必能产生互补黏性末端或平末端，此时需要将DNA修饰以后再连接，修饰的方法有： 1. DNA片断末端同聚物加尾后进行连接 2.黏性末端修饰成平末端后连接 3.DNA片断5端脱磷酸化作用后连接,5.1.2 目的基因的扩增 目的基因获得以后需要对其进行大量的扩增，目前最广泛采用的基因扩增技术是PCR技术（The Polymerase Chain Reaction)，其主要原理是利用了DNA的变性、复性与杂交 5.1.2.1 DNA变性（熔解） DNA在加热或某些试剂作用下，DNA配对碱基之间的氢键结构受到破坏，双链DNA的多核苷键完全分离,DNA变性后的特点 变性后的DNA溶液：粘度降低；沉降速率增高；紫外光吸收急剧增高；生物功能减小或消失。 当吸光度值达到最大值一半时的温度作为熔点温度（Tm） ，Tm的数值主要受到以下因素影响： 1. G+C的含量相关（G+C的含量影响DNA分子的稳定性）G+C高，Tm 高 2.低离子强度溶液中Tm低，熔点范围宽 特定浓度溶液中Tm 与G+C可以互相计算,5.1.2.2 DNA复性 变性DNA在一定条件下恢复双螺旋结构的性质叫复性 DNA复性的过程即DNA分子互相碰撞，互补配对。复性的DNA大部分不是原配，但不影响性质 影响DNA复性的因素有： DNA分子的大小和顺序复杂性 样品浓度、离子强度 温度 （Tm-25）,5.1.2.3 DNA的杂交 复性的DNA分子由不同的两单链分子形成时称为杂交 杂交后可能出现DNADNA 、DNARNA的组合（只要存在有互补的碱基对，而且可以不完全一致，可以有错配、缺失） 杂交可以在溶液中，也可以在固相载体（硝酸纤维素滤膜结合单链核酸不结合双链）,PCR的原理,PCR反应是模仿细胞内发生的DNA复制过程进行的，在体外由酶催化合成特异性DNA片断，其一般反应过程是： 变性 9095 底物双链DNA变成单链DNA 退火 3760 引物与模板配对（复性） 延伸 7075 DNA合成，图,PCR扩增的主要条件,耐热性DNA聚合酶 模板 PCR引物 引物是PCR过程中引导互补链DNA合成的一种脱氧核苷酸寡聚体 PCR原料 dATP、dGTP、dCTP、dTTP是PCR的原料,5.3 基因克隆载体,单独的目的基因一般是不容易进入受体细胞的，如果采用物理方法进入细胞后也不容易在受体细胞中维持，所以目的基因的导入需要选择合适的载体 5.3.1 基因克隆载体 能将外源DNA片断带入受体细胞并在其中得以维持的DNA分子称为基因克隆载体,5.3.1.1基因工程载体的必备条件 含有尽可能多的克隆位点，允许外源DNA片段进入 载体可以进入宿主细胞并自我复制 具有筛选标记 不应含有对受体细胞有害的基因，并不会任意转移到除受体细胞以外的其他细胞 5.3.1.3 载体举例 质粒克隆载体 大肠杆菌质粒载体 ，图,蓝藻穿梭质粒载体 同时蓝藻源质粒载体和大肠杆菌质粒载体，可在大肠杆菌和蓝藻中复制 病毒克隆载体 病毒主要由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒，通过感染进入宿主细胞，利用宿主细胞合成系统进行DNA（或RNA）复制和壳蛋白的合成，图,5.4 目的基因的制备,5.4.1建立基因库和基因文库 基因库又称基因组文库，是将待研究的细胞基因用限制性内切酶切割，得到的DNA片断与载体连接，转移到细菌中，细菌繁殖形成片断DNA的克隆，这一套基因组DNA片断叫基因库。 通常适合于原核生物的基因筛选 基因文库又称cDNA文库，某种生物基因转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDNA（互补脱氧核糖核酸）片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群中,5.4.2 基因组文库的筛选 DNA杂交法（已知核苷酸序列）：目的DNA变性单链DNA高温与硝酸纤维素膜或尼龙膜结合探针单链DNA（放射性同位素或荧光标记）与膜一起保温放射性自显影 ，图 免疫反应法（：在培养基上培养的细菌菌落印在膜上裂解 细菌的蛋白裸露（加入一抗）一抗与蛋白结合（洗去一抗加二抗）二抗与一抗结合（洗去二抗）加显色剂显色,5.5目的基因导入受体细胞,5.5.1 外源DNA转化法 直接转化法（直接混合） 化合物诱导转化法 用二价阳离子处理某些细胞可以使其处于摄取外源DNA的状态 电穿孔转化法 微弹轰击转化法 5.5.2 病毒颗粒转导法 噬菌体DNA分子转导大肠杆菌,5.6重组体的鉴定 利用抗生素抗性基因 营养缺陷互补法 核酸杂交法 原位杂交：重组体菌落或噬菌斑由平板转移到滤膜上并释放出DNA，变性后固定在膜上，再同探针杂交 Southern杂交：重组体DNA限制性酶切分离出目的DNA，电泳分离，再将原位转至膜上，固定以后用探针与其杂交 DNA