《酶工程绪论》PPT课件.ppt

酶工程,Enzyme Engineering 王林嵩,第一章 绪论,第一节酶工程的研究内容 第二节生物催化 第三节 国内外酶制剂工业概况,第一节 研究内容,一概念： 二酶工程研究简史 三研究内容,酶的概念,酶(enzyme)是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。,酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。,酶具有一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。,一 概念,酶工程（ Enzyme Engineering） 酶的生产、改性与应用的技术过程。是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学。 这门学科在研究内容、手段和目的上与基因工程、蛋白质工程、细胞工程、发酵工程等孪生学科是相互交融的。,酶的生产（enzyme production）是指通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。,提取分离法,生物合成法,化学合成法,酶的生产方法,酶的生产方法,提取分离法 (Extraction),生物合成 (Biosynthesis),化学合成 (chemical synthesis),SOD - blood Papain-Papaya Chymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cell,Amylase from Bacillus Protease from Bacillus Phosphatase from Bacillus Glucoamylase from Aspergillus Plant cell culture Animal cell culture,Few example,酶的改性（enzyme improving）是通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶定向进化等。 酶的应用（enzyme application）是通过酶的催化作用获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程，主要包括酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等。,酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作获得人们所需要的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。,化学酶工程 2. 生物酶工程,1 自然酶的开发 2 酶的化学修饰 3 酶的固定化 4 人工合成酶的研究,1 酶基因的克隆表达 2 酶的遗传修饰 3 酶的遗传设计,二 研究内容,研究内容,酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。,微生物酶源是酶工程研究的源流 以基因工程和蛋白质工程改造和设计酶是革命性导向 在30亿年生物进化中，只发现了1055种功能蛋白和酶，经计算，300个氨基酸可组成不同序列的蛋白质约有10390种，因而在自然界，绝大多数新蛋白酶仍未产生，有待人类去进行人工定向进化，创造开发新酶类。,美国宝洁公司用重组DNA技术获得高活性、高稳定性脂肪酶用于去污剂工业。诺维信公司克隆淀粉酶基因重组工程菌，显著提高了产酶速度及酶量，还构建了耐热淀粉酶及脂肪酶应用于工业生产。,构建新酶是酶工程研究的前沿 构建有别于天然功能酶的新酶类，是酶工程研究的又一前沿领地。 抗体酶（Abzyme） 核酶（Ribozyme） 人工合成酶（Synzyme）是合成具有催化功能的高聚物分子,分子水平的酶法分析与生物传感器分子酶工程发展了各种生物分析技术。 酶学与酶工程的研究领域还有固定化生物催化剂及酶反应器的工业应用，以及作为生物功能信息分子参与生命过程调控的糖的酶促合成的糖工程等。,三. 酶工程研究简史,1894年，日本的高峰让吉首先从米曲霉中制备得到淀粉酶（又称高峰淀粉酶），用作消化剂，开创了近代酶的生产和应用的先例。 此后近半个世纪的时间里，都是停留在从动物、植物或微生物细胞中提取酶并加以应用的阶段。 1916年美国的奈尔森（Nelson）和格里芬（Griffin）发现蔗糖酶吸附在骨炭上后，仍然显示出催化活性。,1949年，日本开始采用微生物液体深层培养方法进行细菌-淀粉酶的发酵生产，揭开了现代酶制剂工业的序幕，发酵工程技术发展使酶的生产得以大规模发展。 1960年，法国的雅各布（Jacob）和莫诺德（Monod）提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，从而显著提高了酶的产率。,20世纪80年代迅速发展起来的动植物细胞培养技术，继微生物发酵生产酶之后，已成为酶生产的又一种途径。 随着酶生产的发展，酶的应用越来越来广泛。由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温和等显著的特点，在医学、食品、轻工、能源、环保和科研等领域广泛应用。,1953年，德国的格鲁布霍费（Grubhofer）和施来斯（Schleith）首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合，制成固定化酶。1969年，日本的干畑（tin）一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶进行DL-氨基酸拆分而产生L-氨基酸，从此学者们开始用“酶工程”这个名词来代表酶的生产和应用的科学技术领域。 固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展 。,在固定化酶的基础上，又发展了固定化细胞（固定化活细胞或固定化增值细胞）技术。1978年，日本的铃木等用固定化细胞生产-淀粉酶研究成功。此后，采用固定化细胞生产蛋白酶、糖化酶、果胶酶、溶菌酶、天冬酰胺酶等的研究相继取得进展。 1986年，我国学者郭勇等采用固定化原生质体生产碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、谷氨酸脱氢酶等的研究相继成功，为胞内酶的连续生产开辟新途径。,1984年，克里巴诺夫（Klibanov）等进行了有机介质中酶的催化作用的研究，发现脂肪酶在有机介质中不但具有催化作用，而且还具有很高的热稳定性，改变了酶只能在水溶液中进行催化的传统观念。此后，有机介质中酶的催化作用的研究迅速发展。,20世纪80年代以来，酶分子修饰技术发展很快，修饰方法主要有：酶分子主链修饰、酶分子侧链基团修饰、酶分子组成单位置换修饰、酶分子中金属离子置换修饰和物理修饰等。,随着易错PCR（error-prone PCR）技术、DNA重排（DNA shuffling）技术、基因家族重排（gene family shuffling）技术等体外基因随机突变技术以及各种高通量筛选（high-throughout screening）技术的发展，酶定向进化（enzyme directed evolution）技术已经发展成为改进酶催化特性的强有力手段。,酶的定向进化是一种快速有效地改进酶的催化特性（底物特异性、酶活性、稳定性、对映体选择性等）的手段，通过酶的定向进化，有可能获得具有优良特性的酶分子。酶的定向进化技术已经成为酶工程研究的热点。 经过100多年的发展，酶工程已经成为生物工程的主要内容。在世界科技和经济的发展中起重要作用。,生物学,化学工程,工程学,化学,生物工程,生物化学,生物技术,第二节 生物催化,新兴、前沿学科往往在学科交叉中产生,生物技术,医药生物技术 农业生物技术 工业生物技术 环境生物技术 材料生物技术 . . .,用生物或生物分子机器生产产品和解决问题,生物技术的具体应用,生物技术产业化的三个浪潮,医药生物技术: 1982年重组人胰岛素上市 农业生物技术: 1996年转基因大豆、玉米、油菜相继上市 工业生物技术: 世纪之交聚交酯、生物钢、聚乳酸相继上市,工业生物技术-迈向发达国家之战略,工业生物技术,含意：在工业规模的生产过程中使用或部分使用生物技术来实现产品的制造，这种技术是应用微生物和生物催化剂来提供产品和服务 核心目标：大规模利用生物体系（如细胞或酶）作为催化剂实现物质转化,工业生物技术是生物技术的重要组成部分,工业生物技术发展空间,提升传统产业 生物能源 环境生物技术 生物材料,底物,生物反应器,检测控 制仪表,培养基,（灭菌）,经加工 原料,酶,细胞,生物催化剂 （游离或固定化）,机械能,除 菌,空气,产品提取纯化,副产品 产品 废物,热能,原材料,营养物,典型工业生物技术过程,核心技术？,生物催化（Biocatalysis),利用酶或有机体（细胞或细胞器等）作为催化剂实现化学转化的过程。,生物转化（Biotransformation),外源化学物在机体内经多种酶催化的代谢转化。生物转化是机体对外源化学物处置的重要的环节，是机体维持稳态的主要机制。,生物催化,化学工业,发酵工业,轻工业,采矿,医药,食品,能源,材料,生物安全,环境,生物催化是工业生物技术的核心技术,以生物催化法合成的主要产品,6-氨基青霉烷酸,趋势判断和需求分析,生物催化剂在精细化学品市场中呈现强劲的增长势头。 通过生物催化技术，将实现化学工业的原料消耗、水资源消耗、能量消耗降低30%，污染物的排放和污染扩散减少30%。,趋势判断和需求分析,目前生物催化技术已成为各公司争夺的目标并且已成为一些公司谋求发展和提升地位的工具 。 Degussa、DSM、Roche、BASF、Dow、Lonza等许多跨国公司都在积极采取措施，扩大他们在生物催化领域里的生产能力。,生物催化发展的主要推动力,新产品需求 (社会压力) -健康：医药、检测 -日用品：洗涤用品、乳品、生物可降解塑料 环境 (法律法规压力) 绿色化学、能源、温室效应 新发现或基础研究 (技术压力） 基因工程 /定点突变/定向进化、代谢工程、组合化学 得益/成本降低 (商业压力) -生物分离,The Biocatalysis Cycle,生物催化剂工程的目标,开发生物催化剂：催化性能更好、更快，成本更低 开发生物催化剂工具盒：催化反应更广泛，功能更多样 改善性能: 稳定性, 活性，溶剂兼容性 开发分子模型: 新酶的快速重新设计 创造新技术: 用于新生物催化剂的开发,生物催化剂发展的工业展望,生物催化剂工程技术瓶颈,对生物催化剂作用机理缺乏深入的认识 对次级代谢产物代谢途径（包括途径间相互关系）缺乏理解 细胞工程化的方法十分有限（即代谢工程） 生产酶和辅因子的成本过高,生物催化剂的发现,微生物 可培养微生物酶资源的开发利用 不可培养微生物酶资源的开发利用 基因 已知基因的克隆 未知基因的克隆,当前生物催化的研究热点,新酶或已有酶的新功能的开发 根据已有底物开发新的酶反应 利用突变或定向进化技术改善生物催化剂性能 利用重组DNA技术大规模生产生物催化剂 利用有机溶剂或共溶剂开发新的反应体系 体内或体外合成的多酶体系 克服底物和产物抑制 精细化工品或医药合成技术的放大 辅因子再生 生物催化剂的修饰 生物催化剂的固定化,生物催化剂高效生产与 催化功能研究,强化微生物细胞培养与发酵的调控措施，研究酶的诱导策略 实现生物催化剂的自主和规模生产 分析生物催化剂所催化的特定基团开辟全新的生物催化反应,酶的基本特性,酶的活性中心(active center),又称活性部位(active site)，具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。,（一）酶促反应具有极高的效率,酶促反应的特点,酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比一般催化剂高1071013倍。,1mol过氧化氢酶 5106molH2O2 1mol离子铁 610-4molH2O2,活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。,一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种特性称为酶的特异性或专一性。,* 酶的特异性(specificity),（二）酶促反应具有高度的特异性,根据酶对其底物结构选择的严格程度不同，酶的特异性可大致分为以下3种类型：,绝对特异性(absolute specificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物 。 相对特异性(relative specificity)：作用于一类化合物或一种化学键。 立体结构特异性(stereo specificity)：作用于立体异构体中的一种。,酶作用的专一性,结构专一性,立体异构专一性,族（基团）专一性,绝对专一性,族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。,绝对专一性：只能作用于某一底物。,2NH3 + CO2,（三）酶促反应的条件温和,近中性、常温、常压、含水,（一）底物浓度的影响,影响酶催化作用的因素,S：底物浓度 V：不同S时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) m：米氏常数(Michaelis constant),（二）酶浓度对反应速度的影响,当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。 关系式为：V = K3 E,双重影响 温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低 。,（三）温度对反应速度的影响,最适温度 (optimum temperature)： 酶促反应速度最快时的环境温度。,* 低温的应用,（四） pH对反应速度的影响,最适pH (optimum pH)： 酶催化活性最大时的环境pH。,pH对酶作用的影响机制： 1.环境过酸、过碱使酶变性失活； 2.影响酶活性基团的解离； 3.影响底物的解离。,（五）抑制剂的影响,酶的抑制剂(inhibitor) 凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。,区别于酶的变性,抑制剂对酶有一定选择性 引起变性的因素对酶没有选择性,抑制作用的类型,不可逆性抑制 (irreversible inhibition),可逆性抑制 (reversible inhibition)：,竞争性抑制 (competitive inhibition) 非竞争性抑制 (non-competitive inhibition) 反竞争性抑制 (uncompetitive inhibition),(一) 不可逆性抑制作用,* 概念 抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活。 * 举例 有机磷化合物 羟基酶 解毒 - - - 解磷定(PAM) 重金属离子及砷化合物 巯基酶 解毒 - - - 二巯基丙醇(BAL),（二） 可逆性抑制作用,* 概念 抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。,竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制,* 类型,. 竞争性抑制作用,反应模式,* 举例,丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶,磺胺类药物的抑菌机制 与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶,2. 非竞争性抑制,* 反应模式,. 反竞争性抑制,* 反应模式,（六）激活剂对反应速度的影响,激活剂(activator) 使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。 必需激活剂 (essential activator) 非必需激活剂 (non-essential activator),酶活性测定和酶活性单位,酶的活性是指酶催化化学反应的能力，其衡量的标准是酶促反应速度。,酶促反应速度可在适宜的反应条件下，用单位时间内底物的消耗或产物的生成量来表示。,酶的活性单位是衡量酶活力大小的尺度，它反映在规定条件下，酶促反应在单位时间（s、min或h）内生成一定量（mg、g、mol等）的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。,国际单位(IU) 在特定的条件下，每分钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位。,催量单位(katal) 催量(kat)是指在特定条件下，每秒钟使mol底物转化为产物所需的酶量。,kat与IU的换算： 1 IU=16.6710-9 kat,酶活力测定方法,对酶活力测定的要求是快速、简便、准确。 反应 酶活力测定 测定,酶活力测定的一般步骤,1. 根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。 2. 根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。 3. 在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。 4. 反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。,终止酶反应的方法很多，加热、变性、改变pH、降低温度。 测定可采用化学检测、光学检测、气体检测。 一种酶可以有多种测定方法，要根据实际情况选用。,固定化酶的活力测定,与水不溶性载体结合、在一定的空间范围内起催化作用的酶称为固定化酶。,1. 振荡测定法,称取一定质量的固定化酶，放进一定形状一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在特定的条件下，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应。经过一定时间，取出一定量的反应液进行酶活力测定。 固定化酶反应液的测定方法与游离酶反应液的测定方法完全相同。,2. 酶柱测定法,将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中，在适宜的条件下让底物溶液以一定的流速流过酶柱，收集流出的反应液。测定反应液中底物的消耗量或产物的生成量，再计算酶活力。,3.连续测定法,利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。,4.固定化酶的比活力测定,游离酶的比活力可以用每毫克（mg）酶蛋白或酶RNA所具有的酶活力单位数表示。在固定化酶中，一般采用每克（g）干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。 在测定固定化酶的比活力时，可先用湿固定化酶测定其酶活力，再在一定的条件下干燥，称取固定化酶的干重，然后计算出固定化酶的比活力。也可以称取一定量的干固定化酶，让它在一定条件下充分溶胀后，进行酶活力测定，再计算出固定化酶的比活力。,对于酶膜、酶管、酶板等固定化酶，其比活力则可以用单位面积的酶活力单位表示，即：比活力=酶活力单位/cm2。,5.酶结合效率与酶活力回收率的测定,酶结合效率又称为酶的固定化率，是指酶与载体结合的百分率。一般由用于固定化的总酶活力减去未结合的酶活力所得的差值，再除以用于固定化的总酶活力而得到。 未结合的酶活力，包括固定化后滤出固定化酶后的滤液以及洗涤固定化酶的洗涤液中所含的酶活力的总和。 酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。,6.相对酶活力的测定,具有相同酶蛋白（或酶RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。,酶的分类与命名,酶 enzyme,蛋白类酶（proteozyme）,核酸类酶（ribozyme）,蛋白类酶,氧化还原酶（oxidoreductase）,转移酶（transferase）,裂合酶（lyase）,水解酶（hydrolase）,异构酶（isomerase）,合成酶（synthesase）或连接酶（ligase）,核酸类酶,分子内催化R酶 （in cis ribozyme）,分子间催化R酶 （in trans ribozyme）,自我剪切酶（self-cleavage ribozyme）,自我剪接酶（self-splicing ribozyme）,RNA剪切酶（RNA cleavage ribozyme）,DNA剪切酶（DNA cleavage ribozyme）,多肽剪切酶（peptide cleavage ribozyme）,多糖剪接酶（polysaccharide splicing ribozyme）,氨基酸酯剪切酶（aminoacid ester cleavage ribozyme）,多功能酶（multifunction ribozyme）,第三节：国内外酶制剂工业概况,一 国内外酶制剂生产和应用现状 二 国内外酶制剂生产应用差异 三 我国酶制剂工业的若干对策建议,一 国内外酶制剂生产和应用现状,1. 世界酶制剂公司 Novo Nordisk （丹麦） Genencor International(美国） 德国 AB酶公司 比利时BELDEM 四大公司销售额占世界总额的70%,诺维信酶制剂公司，全球最大的酶制剂公司。公司产品占有中国50%的工业酶制剂市场。总公司位于丹麦，在天津有它的生产基地，并在全国都有分厂和合作工厂。 世界第二大酶制剂公司genencor 已被丹尼斯克收购；,国际市场酶制剂销售额比例,2013年全球酶制剂市场将达70亿美元,二 我国酶工业发展阶段,1. 1965 无锡酶制剂厂 淀粉酶 2. 1979 糖化酶 3. 碱性蛋白酶 4. 中性蛋白酶 5. 1993 耐高温淀粉酶 6. 1998 国外大公司纷纷入驻1999年投产,我国比较知名的酶制剂公司,浙江钱江生物化学股份有限公司 安徽丰原生物化学股份有限公司 无锡杰能科生物工程有限公司 辽宁星河生物有限公司 山东隆大生物工程有限公司 四川达威科技股份有限公司 河南省瑞驰生物科技有限公司 江门甘蔗化工厂(集团)股份有限公司 诺维信(中国)生物技术有限公司 神舟生物科技的限责任公司,国内酶制剂销售额比例,二国内外酶制剂生产应用差异,1 规模：国外多公司重组 国内重复建设、效益低 2. 投入： 国外：开发经费高达15%，甚至19%销售额 国内：研究、开发投入不足，占1%销售额 3. 开发重点：国外：大力研制、开发新酶种和新用途 国内：品种少、剂型少,三我国酶制剂工业的若干对策建议,1走集约化、规模化经营 2 加大科研投入 3 发展具有自己知识产权的新技术 4 . 调整产品结构、大力开发新品种,旅游审美文化,7,陆游；沈园 城上斜阳画角哀， 沈园非复旧池台。 伤心桥下春波绿， 曾是惊鸿照影来。 柴埠溪；情人岩, 如笛卡儿所说 :“同一件事情可以使这批人高兴的要跳舞 ,却使另一批人伤心的要流泪。” 如菊花 中国与西方山水审美观的差异是十分明显的。在人与自然的关系方面，中国哲学主张“天人合一”，“物我一体”，而西方哲学则主张天人对立，物我对立。这种哲学观念的差异，必然导致山水审美观的分岐。 一）、中国人特别关注山水景观所附载的人文美 ;而西方则关注山水景观本身的自然美 滕王阁序 “落霞与孤鹜齐飞 ,秋水共长天一色。” “ 关关睢鸠，在河之洲，窈窕淑女，君子好逑”， 车尔尼雪夫斯基这样来描写水 :“水由于它的形状而显现出美 ,辽阔的、一平如镜的宁静的水在我们的心理产生宏伟的形象。奔腾的瀑布 ,它的气势是令人震惊的 ,它的