2012发酵工程实验指导书.doc

实验一 红曲霉液态发酵制备红曲色素一、实验目的 1、了解和掌握常规育种原理、方法和基本技术；2、熟悉实验室液体发酵基本技术； 3、掌握发酵产物提取工艺和分析检测的一般技术。二、实验用品恒温摇床、恒温培养箱、灭菌锅、紫外分光光度计、电子天平、药物天平、高速离心机、烘箱、pH计、红曲霉菌种、乙醇、葡萄糖、饴糖、大米粉、麦芽糖、麦芽膏、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、氯化铵、甘油、硫酸镁、谷氨酸钠、硫酸铵、硝酸铵、淀粉、常用玻璃仪器等。三、实验步骤1、根据下列工艺流程图，设计具体实施方案并完成实验；液体发酵工艺流程：培养基制备接种发酵提取分析检测2、紫外分光光度法测定红曲色素色价；四、实验要求1、具体的设计方案在实施前交指导教师审核；2、要求随时观察记录实验现象；3、考察碳氮源对发酵的影响；五、实验报告要求1、每小组1份实验方案，每人1份实验报告；2、实验报告中要求对每一步操作和现象做出详细记录并解释；六、思考题1、所提取的红曲色素主要由哪些色素组成？ 2、 红曲色素发酵是厌氧还是好氧发酵？附红曲霉相关资料红曲色素的测定 采用GB4926-85法，测定方法是称取红曲米样品0.50g，放入100ml带刻度具磨口塞试管中，加入70乙醇至50ml，置60水浴保温2h，冷却，滤纸过滤，吸取滤液1.0ml于25ml容量瓶中，70乙醇稀释定容至25ml，分光光度计505nm处测定OD值，测定色价。色素色价即为测得样品吸光度（OD值）乘以稀释倍数。红曲色素含量测定方法取10ml研磨均匀的发酵液，4000r/min下离心15min，去上清液，沉淀加入8 0 % 乙醇2 0 m l ，6 0 保温4 h ，4000r/min 离心15min，取上清液。浸提四次，合并提取液，用8 0 % 乙醇稀释，于5 1 0 n m 处测定其O D 值。液态发酵培养红曲霉的最佳培养基组成为可溶性淀粉70g/L，黄豆饼粉10g/L，酵母浸膏10g/L，MgSO4 1g/L，NaNO3 2g/L，NaH2PO4 1g/L；最佳发酵条件为培养基初始pH值为4.5，接种量16%，装液量150mL/300mL，发酵时间为6d，红曲霉的酯化力达0.4678g/100mL。斜面保藏培养基1：68米曲汁，可溶性淀粉2，蛋白胨1，琼脂2，冰醋酸少许。斜面保藏培养基2：12度的麦芽汁琼脂培养基，pH5.0种子培养基1：葡萄糖3，黄豆饼粉3%，NaNO30.2%，MgSO4 7H2O 0.1%液体种子培养基：玉米粉1，葡萄糖2，蛋白胨1，KH2PO4 0.25%, MgSO4 0.05% , pH5.0。斜面培养基：马铃薯2 0 % ，葡萄糖1 . 5 % ，琼脂2 % ，玉米粉1 % ，接种后于3 2 培养1 5 2 0 d 。500ml 接30管。福建古田红曲霉斜面配方饴糖水：6-8%Be（换算成百分浓度12-16%），100mL可溶性淀粉5%蛋白胨3%琼脂2-2.5%培养温度28-32 7天小米孢子培养基：250ml 三角瓶中加25g 小米，水20ml，接种后32培养1520d。种子培养基：可溶性淀粉3%，NaNO3 0.3%，酵母膏0.5%，KH2PO4 0.15%，MgSO47H2O 0.05%。调节pH5.5，接种后于32，180r/min 培养2d。发酵培养基：碳源、氮源由实验确定，另加入0.1%KH2PO4 和0.05% MgSO47H2O，调节pH 值到5.5，250ml三角瓶装液量120-150ml，接种量10%(V/V)，接种后于32，180r/min 培养96h。实验二 酵母培养中的基质代谢、呼吸和生长的参数检测与参数相关分析一、实验目的 微生物的生长受自身代谢特性和环境的影响，比如在不同的介质中同一种菌的代谢特性和代谢速率会不一样，不同的生长阶段菌的代谢也会不同。在分批培养中，随着微生物的生长，基质的利用，代谢产物的积累，环境发生变化，从而对微生物代谢产生影响。所以测定代谢过程的参数，如菌浓度、基质浓度、pH、溶氧浓度等，并对这些参数的时序变化进行分析及动力学分析，可以使人们对微生物培养过程有一个量化的了解，所以检测代谢参数是过程控制与优化的基本前提，其中基质代谢、氧的消耗与菌体生长密切相关。 本实验力图使学生掌握测定菌体浓度、基质消耗、呼吸相关的各种参数的方法，以及学会分析这些参数的时序变化和相互间的关系。 一种参数可以有不同的检测方法，本实验将选取在实际应用中比较常见的检测项目，使学生通过实验能掌握常用参数的测定方法，并且将实时测定的数据进行时序分析和多参数的关联分析使学生对代谢的网络化有一个初步的认识。二、实验原理 在需氧代谢中，菌体生长是以基质代谢和氧的消耗为基础的，因为他们提供了生长所需要的前体物质和能量，而且从基质和氧的消耗速率也可以反映菌生长的状况和阶段。 本实验在15 L发酵罐中进行酵母培养，可保证发酵全过程生长条件的一致性（较之摇瓶），对菌的生长代谢分析有参数的稳定性和可靠性。酵母的生长以葡萄糖为碳源，随着葡萄糖的利用，酵母生长同时也会产生代谢副产物小分子酸，因此要用氨水调节pH。氨水消耗的多少与糖代谢相关。 分批发酵中，酵母生长会出现延迟期、对数生长期、稳定期、衰亡期等阶段，通过测定菌量就可以了解生长情况与阶段。三、器材与试剂1. 种子培养基配方（1 L）酵母提取物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、pH 5.5。2. 发酵培养基配方（1 L）酵母提取物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、灭菌前pH 5.5，泡敌0.1 %。3. 补糖配方（1 L）葡萄糖200 g、K2HPO4 10 g、MgSO4H2O 1.6 g、NH4Cl 1.4 g。4. 葡萄糖测定SBA40型谷氨酸(乳酸)葡萄糖双功能生物传感分析仪测定，详见第四章实验五十三。5. 15 L全自动发酵罐电极标定（1）pH电极标定将pH电极连上电极线，将发酵罐pH电极标定控制屏幕上的斜率和截距分别设置为1和0；将电极插入pH 6.86（称为标1）的标准缓冲液中，等pH显示的读数稳定后读取读数（称为测1）。拿出电极，用去离子水冲洗电极，并用卷筒纸轻轻的吸干电极头上的水，然后插入pH 4.00（称为标2）的标准电极缓冲液中，等pH显示的读数稳定后读取读数（称为测2）。电极的斜率由下式计算得到： 在发酵罐的控制屏幕上输入斜率，再把电极插入pH 6.86标准溶液中看pH读数与标准缓冲液值得差距，调节截距，使读数等于标准缓冲液pH。这时的截距就是标定的截距。（2）溶氧电极的标定 将发酵罐溶氧电极标定控制屏幕上的斜率和截距分别设置为1和0；在培养基灭菌温度达到115 时，调节显示屏上的斜率读数使溶氧读数为零，此时的斜率读数即为标定的斜率。接种结束后发酵开始时，调节截距使溶氧读数在80 %左右，此时的截距为标定的截距。四、实验操作1. A600与菌体干重的关系测定 酵母是单细胞生物，它在液体中呈单个悬浮状态，因此可以通过测定发酵液的吸光度来得知菌生长量。由于发酵液略显黄色，因此选择的波长要对黄色光吸收尽量地少，本实验选择600 nm，测量A600。菌体干重测定的具体方法如下： 取10 mL发酵液，冷冻离心，转速10 000 r/min，离心10 min，弃去上清液，得到湿菌体，在95 干燥箱干燥12 h，称取干重并除以10。绘图计算得到A600与菌体干重的关系：菌体干重（g/mL）=aA600 + b2. 基质代谢和菌体生长的关系（1）种子培养基的配制及种子培养 种子培养基的配制：按照种子培养基配方，配制1200 mL培养基，并用盐酸调好pH，分装到11个500 mL的摇瓶中，每瓶100 mL，用松棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸包扎好瓶口。放入高压灭菌锅115 ，灭菌15 min。 接种：在超净工作台上用无菌接种针挑取一针斜面菌种，接入已灭菌的种子培养积极，包扎好瓶口，没接种一瓶种子需换一根接种针，以免染菌。 种子培养：放入30 摇床培养，转速230240 r/min，培养16 h。（2）发酵培养基配制及营养 发酵培养基配制：按照发酵培养基配方，计算出10 L培养液所需各成分的含量并称取。用自来水溶解后装入发酵罐，定容至7.5 L。用高压蒸汽直接通入发酵罐灭菌，灭菌体积控制在9 L。灭菌条件：115 ，15 min。 接种：将培养好的种子10瓶，在超净工作台上合并成2瓶，并用无菌棉塞塞好，待接种。火焰接种法从发酵罐的接种口倒入种子，盖上接种口盖子，撤去火圈，调节溶氧浓度到80%。余下的一瓶种子用于菌体干重测定。 发酵过程控制：培养温度：30 ；搅拌转速：200 r/min；溶氧浓度20%以上，当溶氧低于20% 时增加转速，提高供氧；残糖浓度控制在0.5% 左右，低于0.5%时流加20%葡萄糖，流速根据糖耗速率调整。（3）菌浓度测定 发酵6 h开始取样每隔2 h取样一次，至12 h以后每隔4 h从发酵罐取出30 mL发酵液，取其中1 mL适当稀释后用分光光度计在600 nm波长下测定吸光度（A600），要求A600值在0.20.6之间，按照A600干重曲线计算干重，绘制菌生长曲线，即菌体干重对时间的变化曲线。（4）糖消耗曲线 每隔4 h从发酵罐取出30 mL发酵液，取其中10 mL，3000 r/min离心。取0.5 mL上清液残糖。测定残糖用葡萄糖测定仪。绘制糖消耗曲线，即糖浓度对时间的变化曲线。（5）氨水消耗曲线每隔4 h记录一次氨水消耗的体积（mL），绘制氨水消耗曲线。（6）提高溶氧的影响因素 当溶氧低于20% 时，分别采取提高转速或增加通气量来增加溶氧，比较两种调节方法的效果。五、实验内容及安排第一天1. 实验原理及要求讲解。2. 配制种子培养基，灭菌。3. 标定pH电极。4. 21:00接种、摇床培养。第二天1. 8:15配制发酵培养基，进罐灭菌。2. 12:45移种。3. 13:00罐发酵培养。4. 取样，测定菌浓、残糖。5. 每小时按发酵批报项目记录各发酵参数。第三天1. 按发酵批报时间取样。2. 测定菌浓、残糖。3. 根据残糖进行补料。第四天1. 按发酵批报时间取样。2. 测定菌浓、残糖。3. 13:00罐发酵结束，放罐。4. 数据整理与计算处理。第五天撰写实验报告。六、数据记录（表2-1）表 2-1 发酵条件及酵母培养记录表种子编号日期发酵批号时间斜面接种时间总发酵时间0/0#2/1#4/2#6/3#8/4#12/5#16/6#种子接种时间日期发酵接种时间时间总发酵时间20/7#24/8#28/9#32/10#36/11#40/12#42/13#发酵条件葡萄糖g/L酵母粉g/L蛋白胨g/L总体积/L灭菌前pH灭菌后pH接种pHpH斜率pH截距溶氧斜率溶氧截距发酵温度发酵pH操作时间日期时间发酵总时间操作类型/操作参数转速/( rmin-1)NaOH /g状态参数溶氧/%pH温度/糖/( gL-1)A600七、数据处理1. 计算基质得率常数YX/S。2. 绘制酵母生长速率曲线、基质消耗速率曲线。3. 绘制酵母生长曲线、基质消耗曲线、氨水补加曲线。4. 比较糖消耗与菌体生长、氨水消耗的关系。八、实验报告主要内容1. 实验原理与目的