污染生态修复微生物技术.ppt

污染生态修复,微生物技术,第一节 微生物修复技术,微生物修复是指微生物将土壤、水和大气中的有毒有害物质“就地”降解成二氧化碳和水，转化为无毒、无害物质的方法。实际上，大多数环境中都存在着天然微生物降解净化有毒有害污染物质的过程，只是自然条件下的微生物净化速度比较慢。,微生物修复大多都是在人为的条件下进行的，通过提供氧气，添加各类营养物质，接种经过驯化培养的高效菌株等强化修复过程，迅速去除污染物质，这就是微生物修复的基本原理。,与化学、物理修复相比，生物修复具有下列优点：,（1）可使污染物在原地被降解清除，可使污染场所的干扰和破坏达到最小； （2）操作简便，对周围环境干扰较小； （3）二次污染少，永久性的消除污染物和长期的隐患。 生物修复被认为是最有发展前景的技术。,生物修复技术也存在不足：,（1）条件苛刻，生物修复是一种科技含量较高的处理方法，其处理方法必须符合污染场地的特殊条件. （2）有些污染物经微生物降解后其产物的毒性和移动性均比原化合物有所增加.,一、微生物修复技术的分类 污染地区的微生物修复技术一般分为原位生物修复、异位生物修复、原位异位联合的生物修复技术。,1. 原位生物修复技术,原位生物修复是指对受污染的介质不进行搬运或输送，而在原位或易残留的部位进行的生物修复处理。 原位修复技术主要取决于被污染介质自身微生物的自然降解能力、人为创造的降解条件、促进微生物生长繁殖的条件，如提供N、P等营养物、氧气、菌株等。为了加速降解进程有时也加入经驯化和培养的微生物。,原位生物修复包括以下几种方法: （1）投菌法 （2）地耕法 （3）生物通风法 （4）生物注气法 （5）生物扩增法 （6）生物冲淋法,（1）投菌法,直接向受到污染的土壤或水域介入经过人为驯化和培养的微生物以及商品化的适宜微生物菌剂，同时提供这些微生物生长所需的营养，包括大量元素(氮、磷、硫、钙、钾、镁、铁、锰等)和微量元素。,（2）地耕法,地耕法 (land farming)就是通过翻耕土壤，在土壤中混匀并且充入氧气，提高土壤的通透性，创造污染物被氧化的条件，投加肥料、调节土壤湿度及酸碱度等，从而为微生物的生存提供良好环境条件，并确保生物降解在不同土壤层面上都能发生，使污染物能较好的清除的方法。,（2）地耕法,这种方法的优点是结合农业措施，操作简单，经济易行，但污染物有可能从处理地被转移。一般在污染土层较浅、通透性较差、污染物较易被降解的情况下可以采用这种方法。,（3）生物通风法,生物通气法（bioventing) 是一种强迫氧化的生物降解方法。是指向土壤含水层以上的土层中通入空气或氧气，为好氧微生物提供最终电子受体，促进污染物生物降解的技术。 生物通气法的具体措施是向地下水位以上的土层中打两口以上的通气井，用鼓风机和抽真空机将空气强行排入土壤中，然后抽出，土壤中挥发性的污染物也随之去除。在通入空气时，通过加入适量的氨气为土壤中的降解菌提供氮素营养，可以促进微生物降解活力的提高。,（3）生物通风法,土壤的结构和类型直接影响着生物通气法的修复效率，不合适的土壤结构会使氧气和营养元素在到达污染区域之前就被消耗。因此生物通气法只适用于具有多孔结构的土壤污染修复。生物通风法设备费用低，运行维护费用也低，是一种很好的生物修复方法。,（4）生物注气法,生物注气法（biosparging)是指将加压后的空气压入地下水位以下土层中，气流使化合物进入水分不饱和层并进行挥发和降解，同时水分饱和层也得到氧气，有利于污染物降解的一种生物降解方法。这种方法提供了充足的溶解氧，扩大了生物降解的面积，使水分饱和层和不饱和层的土著微生物均能发挥作用。,生物注气法适于处理受挥发性有机物污染的地下水及上层土壤，在常温下空气注入可溶解的氧质量浓度达到812mg/L，是最简单、最经济的形式。纯氧和臭氧注入可使溶解氧浓度达到4050mg/L，但成本很高，一般较少采用。,（5）生物扩增法,生物扩增法(bioaugmentation)是指通过改变微生物及营养状态（N、P）等，提高土著或外源微生物的代谢能力，进而使有机污染物的降解效率显著提高的一种降解方法。对于一些不易降解的有机污染物，通常需要引入具有高效分解和利用能力的特定微生物。构建遗传工程菌可能是处理这类有机物的一种有效手段。,（6）生物冲淋法,生物冲淋法（bioflooding) 是指通过注入井和注入沟将含有营养物和氧的水补充到亚表层，促进污染物降解的过程。生物冲淋法主要应用于各种石油烃类污染的修复中,其具体工程主要包括两组水井，一组是注水井，它的作用是将各类接种的微生物、水、营养物和电子受体等物质注入土壤；另一组是抽水井，通过液体流动促进营养物质的运输，保证充足的氧气 生物冲淋法处理方法简单，费用相对较低，其不足之处是处理时间较长，而且在微生物的修复过程中，污染物可能会进一步扩散到较深层的土壤和地下水中,2. 异位生物修复技术,异位生物修复是指被污染介质(土壤、水体)搬动或输送至它处进行的生物修复过程。相对于原位生物修复而言，更强调人为的控制和创造更适宜的生物降解环境。 异位生物修复的工程措施和根本方法一般可以采用土著微生物，也可以利用外加的降解微生物，这种处理方法能更好的被控制、技术难度低，但成本较大。,异位修复技术涵盖广泛，应用较多的为以下几种方法 （1）堆层处理 （2）堆肥法 （3）预制床法 （4）厌氧反应器 （5）生物反应器,（1） 堆层处理,是一种复杂的生物修复技术，将受污染的土壤从污染地挖掘出来，防止污染物向地下水或更大的地域扩散，运输到一个经过处理的地点堆积在不透水的衬层上，在堆放的土壤中设置通气管道，通入氧气或空气，以促进污染物的好氧降解。,（2）堆肥式处理,在人工控制条件下，使有机废物发生生物稳定作用的过程。处理时直接掺入了能提高处理效果的支撑材料，如木屑、稻草、粪肥、泥炭、树皮等易堆腐物质，使用机械翻动或压气系统充氧，并补充氮和磷以及其他无机盐，同时调节好pH值和通气条件，使微生物的降解活性大大提高。经过一段时间的发酵处理，大部分污染物被降解，标志着堆肥的完成，经处理消除污染后的土壤可返回原地或用于农业生产。,（3）预制床法,是一种用于土壤修复的特制生物床反应器，包括水及营养物的喷淋系统、土壤底部的防渗衬层、渗滤液收集系统及供气系统等。在不泄漏的平台上，铺上石子与沙子，将污染土壤以1530cm的厚度平铺其上，并加入适当的营养液和水，定期通入氧气并翻动土壤，以保证土壤中微生物生长的合适条件。处理过程中流出的渗滤液，回灌于该土层上，以便彻底清除污染物。,（4）好氧生物反应器,生物反应器是一种处理污染土壤的特殊反应器。反应器可建在污染现场或异地处理场地。通常为卧室鼓状、气提式，可分批培养或连续培养。处理时将污染土壤转移到生物反应器中，加入39倍的水充分混合使其呈泥浆状，同时加入各类营养物质，并在氧气存在的条件下剧烈搅拌，使微生物与底物充分接触，完成处理过程。,（5）厌氧反应器,大多数生物修复的方法都是在好氧的环境中进行的，事实上在厌氧的环境中进行的生物修复也是有很大潜力的。大量实验表明，厌氧处理对某些污染物如三硝基甲苯、多氯联苯(PCB)等的降解比好氧处理效果更好。,（5）厌氧反应器,现在已经有许多如厌氧生物反应器类的厌氧生物技术，但厌氧修复条件不太好控制，且厌氧修复过程中会产生一些毒性更大、更难降解的中间代谢产物。此外，厌氧发酵的终产物(H2S和CH4)也存在一些风险和毒性，因此其应用少于好氧处理。,3. 原位异位联合生物修复技术,原位异位联合的生物修复是指在实行原位生物修复时，若使用原位修复存在较大的困难，或者污染物的浓度过高，甚至可能对生物产生毒害作用时，可采用一些辅助手段，即将修复场所中的一部分污染物引出，然后将其移至到生物反应器或其它净化设施中进行净化的技术，但是整个过程必须保证原位修复的基本特性。,（1）冲洗-生物反应器法：用水充分的冲洗土壤中的污染物，并将含有该污染物的废水经回收系统转移至生物反应器中，同时连续供给氧气、各类营养 和降解菌等以清除污染物。 （2）土壤通气-堆制法：采用生物通气法去除污染土壤中易挥发的有机污染物，然后再进行堆肥式处 理，清除难挥发的污染物。,二、微生物修复技术的影响因素,1. 微生物种群 2. 污染物特性 3. 氮源和磷源 4. 其他影响因素,1. 微生物的种群,污染地的微生物种群对生物修复技术起到了关键性的作用，在应用高效降解菌修复污染土壤时，修复的效果要取决于微生物在不同污染生态系统中的存活能力，其生长限制因素包括与其它微生物的竟争、土壤的营养条件等。,2. 污染物特性,污染物的化学性质和污染源的存在形式直接影响生物修复的效率。对于水中溶解度小或疏水性强的污染物，其表面活性剂可以促进污染物和微生物的接触机会，从而提高污染物的微生物修复效率。,3. 氮源和磷源,适当添加各类营养物或改变污染土壤的C：N：P值对污染物的生物降解有很大的帮助。,4. 其他影响因素,大量研究表明，土壤湿度越大，其污染物的转化效率越高。但也有研究表明，实际修复中，土壤湿度不宜太大，这是由于土壤湿度增加会使土壤空隙减少，进而阻止氧气的传递。增加土壤湿度可以提高生物修复的活性，加快降解速度。,4. 其他影响因素,土壤通气量对降解也有一定影响。通气可为烃污染土壤中的微生物提供充足的电子受体，可保持土壤pH值稳定，从而促进了微生物的生物活性，强化了它们对污染物的氧化降解作用。,第二节 微生物的定义及特点,一、微生物的定义,一般指体形在0.1毫米以下的小生物。包括病毒、原核和真核生物；单细胞、简单的多细胞、甚至无细胞结构 必须借助于光学甚至电子显微镜才能看见,动物,植物,生物,菌,病毒,细菌,真菌,藻,微型动物,“微型植物”,虫,二、微生物的特点,（一）个体极小，比表面积大 （二）食谱广，代谢类型多、速率快 （三）种类多，分布广 （四）繁殖速度快，易变异,例如 杆菌的长度约2um，故1500个杆菌头尾衔接起来仅有一颗芝麻长(3mm)。,(一)个体极小，比表面积大,光学显微镜的分辨率为0.2um，可以看见大部分微生物的轮廓,艾滋病毒攻击人体淋巴细胞 电子显微镜放大十万倍 4mm:40nm,病毒小于02um，在光学显微镜可视范围外，需通过电子显微镜才可看见，电子显微镜的分辨率为0.20.4nm,利用电子显微镜可以是清晰地看见各种微生物的结构。,30万倍,对微生物生存有何好处？,有利于细胞吸收营养物质和加快新陈代谢。,有人计算，乳酸杆菌一小时内生成的乳酸约为其体重的100010000倍；但一个人如要产生相当于其体重1000倍的代谢物则需要40多年。,(二)食谱广、代谢类型多速度快,理论上讲地球上所有的污染物都可以进入微生物的食谱，成为微生物的营养；,核心是如何搭配，作到微生物既爱吃还容易消化；,代谢（metabolism）：,细胞内发生的各种化学反应的总称,代谢,分解代谢(catabolism),合成代谢(anabolism),复杂分子 (有机物),分解代谢,合成代谢,简单小分子,ATP,H,根据微生物代谢有机物的过程中脱氢、递氢和受氢体的不同,代谢是可以调控的,微生物的代谢可通过酶的合成/活性；底物和产物进行调控。,（三）数量多、分布广,因为繁殖速度快，所以数量多 凡有微生物生存的地方，它们通常都拥有巨大的数量。 例如：(1)土壤是微生物的“大本营”，其中细菌数量达数亿个g，放线菌孢子达数千万个g，霉菌孢子达数百万个g，酵母菌达数十万个g;,(2)全世界海洋中微生物的总重量约280亿吨,(3)人体肠道内菌体总数达100万亿个左右。 人体细胞数量50万亿,(4)新鲜叶子表面微生物数量达100多万个g,(6) 一个喷嚏约含菌4，500150，000个，感冒患者的一个喷嚏含细菌多达8，500万个。,(5) 每张纸币上的细菌数平均多达900万个，大肠杆菌检出率达879。,分布在地球的每一个毛孔，地球真正的主人,分布广,美国黄石国家公园温泉,最原始的细菌,一些嗜盐细菌甚至能在饱和盐水中正常生活；,嗜盐红螺菌大量滋生时的红盐田,产芽孢细菌和真菌孢子在干燥条件下 能保藏几十年、几百年甚至上千年。 耐酸碱、耐缺氧、耐毒物、抗辐射、 抗静水压等特性在微生物中也极为常见。,(四)繁殖速度快、易变异？,生物界中，微生物具有最高的繁殖速度。尤其是以二分裂方式繁殖的细菌，其速度更是惊人。,微生物的繁殖分有性和无性繁殖,在适宜的环境条件下，十几分钟至二十分钟就可繁殖一代。伤寒杆菌在含0.125的蛋白胨培养基中的代时为800min，而在含1.0时仅为40min。 在物种竞争上取得优势，这是生存竞争的保证。,(四)繁殖速度快、易变异？,各种生物自发变异频率十分低(如10-510-10） 保护能力差、数量大 多数微生物为单细胞，结构简单，整个细胞直接与环境接触，易受环境因素影响，引起遗传物质DNA的改变而发生变异； 由于数量庞大，可以在短时间内出现大量变异后代，当环境变化时，微生物会大量死亡，活下来的微生物往往会发生结构和生理特性的变异以适应变化了的环境。,微生物的“生物界之最”,个体最小,形态最简,胃口最大,食谱最广,繁殖最快,数量最多,变异最易,抗性最强,休眠最长,种类最多,分布最广,起源最早,第三节 环境微生物技术,传统微生物技术 细菌的富集与培养 细菌的分离与纯化 菌种的保存 现代生物技术,一、微生物的富集与培养,1.采样：选取目标污染物污染严重的土壤、底泥、水体作为采样地点。 2. 富集与培养 a 无菌操作分别取泥样1g或水样1mL于培养管中（培养液已经灭菌处理）； b 恒温摇床培养1-2周。,（一）培养基,概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。,固体培养基 用于微生物的分离、计数、鉴定 液体培养基 常用于工业生产,分类,微生物需要的营养物质,（1） 一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐等营养物质 （2）还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质 (例如生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素)以及氧气、渗透压等的要求。,1、消毒,使用较温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。,2、灭菌,使用强烈的理化因素杀死物体内所有的微生物，包括芽孢和孢子。,（二）无菌技术,常用的消毒方法,1、煮沸消毒法：100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 3、用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒 4、氯气消毒水源 5、紫外线消毒 ,1、灼烧灭菌 2、干热灭菌：160 -170 下加热1-2h。 3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min。,常用的灭菌方法,（三）倒平板技术,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,二、微生物的分离与纯化,平板划线法 稀释涂布平板法 稀释培养法,（一）平板划线的操作,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,第一步灼烧是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,（二）稀释涂布平板法,（三）稀释纯化法,1,2,3,4,5,6,7,0.1ml的10-1菌液,注意：每次稀释前摇匀！,10-7,10-6,10-5,10-4,10-3,10-2,10-1,分离单菌落,10-7,10-6,10-5,取0.1ml,加