液体活检.pptx

液体活检-肿瘤防治利器,Outlines,分子医学时代的入口,分子医学时代的来临,3,精准医疗：Precision Medicine Initiative 在恰当的时候给患者以精准的治疗 Delivers the right treatment at the right time,液体活检，分子医学的入口 “三驾马车”：CTC、ctDNA 和外泌体,分子医学时代的入口,液态活检通过非侵入性的取样方式获得肿瘤信息，辅助癌症治疗，是“精准医疗”代表性的诊断技术。作为传统活检的替代技术，以及癌症早期筛查的新技术，液体活检正进入发展的黄金时期，,Exosomes 活细胞分泌，40-100nm，1个活细胞状况实时监控指标 母细胞来源标志物（RNA蛋白质），可用于早期诊断 稳定，含量较高，内容物多样性，受干扰因素少 检测相对简单,ctDNA 死细胞释放，杀伤性治疗效果的实时监控指标 ctDNA是一组Panel，癌变标志物，没有组织特异性和无癌症分期的区分 不稳定，含量较低，受干扰因素多,CTC 中晚期癌症指标，目前主要用于预后 新的研究结果显示在早期癌症患者外周血中也能检测到CTC 正在向活细胞捕获发展，用于后期分子分型，及药物选择 稳定但含量较少，分离鉴定难度大，依赖于新的技术进步,复发监控 用药指导 超早预警,早癌发现 鉴别诊断 疗效监控,预后评估 转移分析 药物选择,CTC、ctDNA 和外泌体的差异,分子医学时代的入口,CTC、ctDNA 和外泌体在肿瘤各阶段的应用,血清蛋白标志物 血清/尿液外泌体蛋白标志物 （中晚期诊断及疗效判断）,血浆甲基化标志物 血清外泌体miRNA标志物 尿液外泌体RNA标志物 （早癌诊断、鉴别及疗效判断）,ctDNA Panel 外泌体/血小板RNA panel （早筛预警及现实风险评估）,组织个体化用药标志物 ctDNA用药检测标志物 CTC预后评估,分子医学时代的入口,ctDNA的研究进展和临床应用,ctDNA的来源,ctDNA的研究进展和临床应用,标志组合（panel） 每种肿瘤都有数百基因，数千位点的不同ctDNA，包含不同的突变。 不断演变及变化 每个人、每个肿瘤、不同阶段、不同时间、不同治疗，其突变基因、位点、种类及含量都在动态变化。 高度碎片化 碎片大小范围分布在从30b-250bp，多数在140bp-160bp。 含量少且变化大 cfDNA中多数野生背景，不同ctDNA片段的含量从0.01%到10%； 超早期、高肿瘤特异性，但缺少组织和器官特异性,ctDNA的特征,ctDNA的研究进展和临床应用,ctDNA的临床应用,无创、全面、实时、便捷,ctDNA的研究进展和临床应用,ctDNA指导用药,CAPP-Seq NGS用于血浆ALK&ROS1融合检测,8例患者在血浆中均检测出ALK或ROS1融合 接受克唑替尼治疗后，肿瘤缩小,- AM. Newman,et al.Nat Med 2014,ctDNA预后评估,1. ctDNA有PI3KCA检出的乳腺癌患者，其预后要比没有检出的患者差。,- Breast Cancer Res Treat,2015,March,2. ctDNA中PI3KCA拷贝数高的乳腺癌患者，其预后要比拷贝数低的患者差。,ctDNA的研究进展和临床应用,ctDNA动态监测,ctDNA的研究进展和临床应用,分别采集肿瘤样本和血液样本，对比了同一时间点采集的ctDNA和活体组织切片 血液样本中的游离肿瘤DNA与活体肿瘤样本测序结果相匹配,- J Clin Oncol.2014 Feb 20;32(6):579-86,ctDNA的研究进展和临床应用,ctDNA的研究进展和临床应用,ctDNA检测平台,ctDNA临床应用瓶颈,NGS在ctDNA上应用的难点,假阳性问题：需要纠错技术 NGS仪器本身问题：NGS是采用边合成边测序，合成过程掺入错误千分之几，甚至百分之几，需要鉴别“真突变”而不是引入的“假突变”。 2. 多重PCR扩增过程会引入一定比例的“假突变”。 3. DNA上遗传SNP的干扰。 漏检问题：需要补救技术 1. 技术本身问题。如ctDNA加接头，有效性仅10-15%，丢失80-90%片段信息； 2. 超低频ctDNA在PCR扩增中淹没，也就是偏向扩增导致低频ctDNA片段遗失； 3. 断裂点附近的突变，在靶向富集后多重PCR中无法扩增； 4. 分析过程中无法分辨真实突变，真突变被舍弃。,ctDNA临床应用瓶颈,ctDNA靶向测序建库方法,Ion Ampli-seq ABI公司独有技术，通过多重PCR靶向扩增目的片段，能够以FFPE gDNA和血浆cfDNA为模板进行建库 主要特点：能够特异性扩增目的片段，但受限于扩增体系引物间的互相干扰，靶位点数会受到限制，位点过多可能需要分多个引物pool，且扩增产物存在引物二聚体需要纯化去除。 捕获建库+单分子标签 目前主流，技术相对成熟，90%研究者采用该方案，代表公司如Guardant Health、Foundation、Roche、吉因加、燃石等 主要特点：DNA探针或RNA探针杂交捕获，一次捕获多个目标区域，成本相对较高，无法随时增位点，无法检测断裂点附近的突变位点 单链成环单分子标签 非主流，技术独创性强，代表公司如贝瑞和康、安可济等 主要特点：DNA分子单链成环，RCA扩增或多重PCR扩增建库，成本低，不需要合成探针芯片，随时可以增加位点，对靠近断裂点的突变位点有较好的检查率，单背靠背扩增受一次引物对数量制约（通量受限）,ctDNA检测技术尚在不断发展中，还需要提升精准度，避免假阳性，减少漏检； 临床大样本验证ctDNA技术和检测panel，包括从泛癌种到单肿瘤，尤其是肺癌等常见癌症的ct