肿瘤靶向性药物个体化治疗李智课件

,全国第四届个体化医学培训班，长沙，2011-6-,个体化医学长沙论坛,中南大学湘雅医学检验所 卫生部临床药理国家培训中心,李智 中南大学湘雅医学检验所,肿瘤靶向性药物个体化治疗,人类基因组计划 (HGP)：1996-2003 确定人类基因组所携带的全部遗传信息，并确定、阐明和 记录组成人类基因组的全部DNA序列,人类基因组研究,人类基因组计划，1996 完成人类基因组的常染色体测序. Nature 2004; 431 (7011): 931-945. 国际人类基因组单体型图计划，2005 旨在确定和编目人类遗传的相似性和差异性。利用HapMap获得的信息，研究人员将能够发现与人类健康、疾病以及对药物和环境因子的个体反应差异相关的基因。目标是通过比较 不同个体的基因组序列来确定染色体上共有的变异区域 Nature 2005: 437(7063):1299-1320 DNA元素百科全书 (ENCODE) 计划 2003 建立人类基因组1%目的基因中生物功能关键性元素目录 Nature 2007; 447(7146):799-816 千人基因组计划， 2008 国际千人DNA测序. 查出千个人中基因组的差异 Science 2008; 319(5863):395,Source: U.S. DOE (), Human Genome Project Information,美国FDA批准的靶向性治疗药物,方框内药物为美国FDA要求和推荐检测药物分子靶标的遗传变异情况。,药物名称,商品名称,分子靶点,药物性质,针对肿瘤类型,帕尼（Panitumucetumab),维克替比（Vectibix）,曲妥珠（trastuzumab),贝伐（bevacizumab),利妥昔（rituximab),替伊莫（ibritumomab tiuxetan),托西莫（tositumomab-I131）,吉妥（gemtuzumab ozogamicin）,almtuzumab,伊马替尼（imatinib mesylate),吉非替尼（gefitinib),埃罗替尼（erlotinb),舒尼替尼（sunitinb),索拉非尼（sorafenib),硼替佐米（bortezomib),赫赛汀(Herceptin),阿瓦斯丁（Avastin),美罗华（Rituxan),泽娃灵（Zevalin),Bexxar,麦罗塔（Mylotarg),坎帕斯（Campath),格列卫（Gleevec),易瑞沙（Iressa),特罗凯（Tarceva),Sutent,多吉美（Nexavar),万珂（Velcade),EGFR,HER-2(c-erB2),VEGFR,CD20,CD20,CD20,CD33,CD52,BCR-ABL、,KIT、PDGFR,EGFR,EGFR,VEGFR、KIT、,FR、FLT3,VEGFR2、PDGFR,28S protease,mAb,mAb,SMI,SMI,SMI,SMI,SMI,mAb,mAb,mAb,mAb,mAb,mAb,SMI,结直肠癌、头颈鳞状细胞癌,乳腺癌,白血病,非小细胞肺癌,非小细胞肺癌、胰腺癌,胃肠间质瘤、肾癌,肾癌,多发性骨髓瘤,结直肠癌,B细胞淋巴癌,B细胞淋巴癌,B细胞淋巴癌,急性粒细胞白血病,B细胞慢性淋巴细胞白血病,胃肠间质瘤、慢性粒细胞,B-raf、FLT3,西妥昔（cetuximab),爱必妥（Erbitux）,EGFR,mAb,结直肠癌、头颈鳞状细胞癌,肿瘤靶向性治疗药物作用机制,临床研究处在的EGFR类靶向药物：H447、MDX210（双能EGFR抗体，嵌合CD64抗体）。目前由超过20种EGFR抗体药物正在研发中；小分子靶向治疗药物:吉非替尼、埃罗替尼和依马替尼分别作用于EGFR和c-KIT受体。,肿瘤靶向性药物个体化治疗检测临床应用,西妥昔、帕尼疗效预测 吉非替尼、埃罗替尼疗效预测 伊马替尼疗效预测 曲妥珠单抗疗效预测,肿瘤靶向性药物个体化治疗,一、K-ras基因检测与结直肠癌靶向性药物治疗,CRC靶向性药物治疗,结直肠癌（CRC）靶向药物治疗： -EGFR（epidermal growth factor ）抑制剂：小分子化合物和EGFR抗体 -血管生成抑制剂：VEGFR抗体（贝伐单抗Bevacizumab） EGFR抗体： -Cetuximab （西妥昔单抗）：鼠源性嵌合型抗体 -Panituximab(帕尼单抗）：人源化抗体,临床研究表明，anti-EGFR靶向治疗可使CRC患者生存期延 长1倍（无基因突变） 当患者EGFR信号通路出现基因突变时，anti-EGFR可能抗 体不起作用。,KRAS蛋白,BRAF蛋白,AA,细胞分化,细胞凋亡,增殖,迁移,血管增生,PTEN蛋白 10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因蛋白,磷酸肌醇3激酶,EGFR信号传导通路,EGFR相关基因突变与EGFR抗体疗效,EGFR： 突变频率：1015% 疗效：没影响？更好？ BRAF： 突变频率：810% 疗效：可能相关 PI3K ： 突变频率：1015% 疗效：相关与否？ PTEN ： 突变频率：1015% 疗效：相关与否？,RAS原癌基因： 突变频率：KRAS 40%；NRAS 35%；HRAS 01% 疗效： KRAS与疗效密切相关； NRAS？ HRAS？,KRAS基因突变的影响,KRAS基因状态：野生型、突变型 野生型的KRAS蛋白由上游EGFR活化而 导致短暂激活，其后迅速失活。KRAS 激活/失活效应是受控的。 突变型KRAS蛋白导致蛋白功能异常， 在无EGFR活化信号刺激下仍处于激活 状态，其功能状态不可控，导致肿瘤 的持续增殖等。,KRAS基因突变与EGFR用药指针,KRAS基因突变与西妥昔单抗疗效相关,J Clin Onoclogy 26(3):1374-9, 2008,A.无进展生存期,B.总体生存期,西妥昔治疗组间疗效比较,西妥昔单抗仅可在野生型个体中改善总体生存率,N Engl J Med 359;17 October 23, 2008,KRAS基因突变与西妥昔单抗疗效相关,A Mutation KRAS,B Wild-type KRAS,Overall Survival(%),Months after Randomization,Months after Randomization,Overall Survival(%),西妥昔治疗与对照支持疗法疗效比较,N Engl J Med 359;17 October 23, 2008,KRAS基因突变与西妥昔单抗疗效相关,A Mutation KRAS,B Wild-type KRAS,Progression-free Survival(%),Progression-free Survival(%),Months after Randomization,Months after Randomization,西妥昔单抗仅可在野生型个体中改善无进展生存率,KRAS基因突变种类,基因点突变最常见方式，多发生在 codons12，13，61密码子上 KRAS基因突变96%发生在12、13号密码子上 G12D(35GA):12号密码子编码甘氨酸突变成 天门冬氨酸为最主要形式,GGT GGC GT 12号密码子 13号密码子 G/c/t/a G/c/t/aT G/c/t/a G/c/t/a CGT 12号密码子 13号密码子,K-ras突变种类及频率,K-ras突变总频率,39%,61%,WT,Mutation,Insufficient material,0%,石蜡包埋组织标本切片,刮取切片或直接溶解 （放在EP管里的标本）,选取至少含50%肿瘤 组织的切片,试剂盒提取DNA,KRAS基因突变检测流程,DNA浓度检测（质控）,目的片段扩增（生物素标记的PCR引物扩增）,制备目的基因片段单链 DNA模板,上机检测与结果分析、 发报告,KRAS基因突变检测送样要求,若不能按上述操作提供样本，请提供10张标准不染色的石蜡组织切片,石蜡包埋肿瘤组织块:石蜡包埋组织1块，常温保存、 运输。剩余蜡块归还。 石蜡包埋肿瘤组织切片： 1. 切片厚度10m，8-10片。 2. 不需铺片和贴片，组织切片转移至小塑料离心管（EP管）。 3. 每管放5张面积约250 mm2（成人拇指盖大小）的肿瘤组织切片。 4. 如果肿瘤组织切片的面积较小，请适当增加切片的数量（不超过12张）。 5. 送样时分装两管，用于检测和备份。 6. 样本常温保存、运输。,KRAS基因突变Pyrosequencing检测图谱,12、13密码子分别为野生型：GGT和GGC,12密码子为突变型：GAT,12密码子为突变型：GTT,12密码子为突变型：TGT,13密码子为突变型：AGC,13密码子为突变型：GAT,KRAS基因突变检测报告,二、非小细胞肺癌与EGFR基因突变检测,肿瘤靶向性药物个体化治疗,EGFR 非小细胞肺癌治疗重要靶标,TK,TK,ATP,ATP,细胞增殖,细胞凋亡,血管生成,基因转录翻译 细胞周期进程,+,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC) 组织与正常组织比较与更高的EGFR表达. EGFR 对肿瘤的增殖、分化、迁移等作用起重要作用. 对EGFR 的抑制可阻断下游的信号传导活性. EGFR 抑制药没有严重的毒性反应.,放化疗抵抗,细胞迁移扩散,NSCLC靶向治疗药物,-85%96%的突变为分别发生第19（缺失突变）和第21（L858R-亮氨酸精氨酸）的突变，少部分发生在20号外显子，极少部分发生在18号外显子 -与EGFR-TKI反应活性相关,EGFR突变主要发生洛氨酸激酶域,EGFR 基因主要突变,Lynch TJ, et al. N Engl J Med. 2004;350(21):2129-2139,EGFR 基因主要突变,EXON 18,EXON 19,EXON 20,EXON 21,EXON 22,EXON 23,EXON 24,G719X 4%,Del E746-750 23%,Del E746-751 ins S 12%,Del E746-753 ins S 14%,L858R 39%,L861Q 1%,S768I 1%,Exon20 ins 5%,C790T 1%,19外显子突变占49%，21外显子突变占40%，20号外显子占7%，18号外显子突变只占4%。因此，通常检测EGFR突变只检测19、20、21号外显子或19、21号外显子。 注： C790T为耐药突变，用药3至6个月后，须接受耐药突变，为是否继续用药提供参考。,A.无进展生存时间,B.总生存时间,Han et al. J Clin Oncology 23(11),2006,EGFR突变与吉非替尼、埃罗替尼疗效,酪氨酸激酶抑制剂(EDFR TKI) :吉非替尼,埃罗替尼 主要用于非小细胞肺癌。绝大多数非小细胞肺癌病人对吉非替尼无反应，但约1015% 的病人对吉非替尼表现出快速，且非常显著的临床疗效。 EGFR基因18-21号外显子编码酪氨酸激酶区，此段基因序列发生突变后会使EGFR被配体激活后磷酸化程度升高或持续激活下游信号通路，从而使TKI抑制剂吉非替尼的疗效更好。,EGFR突变与吉非替尼、埃罗替尼疗效,EGFR突变与吉非替尼疗效,突变者1年和18个月存活率者为90%和80%，而野生型分别为60%和40%,19号外显子的缺失突变平均存活时间为34个月，大大长于21号外显子突变者的8个月，后者的存活时间也比野生型长。,EGFR突变与吉非替尼、埃罗替尼疗效,EGFR 突变检测流程,EGFR 突变检测标本送样要求,石蜡包埋组织标本要求同前,外周静脉非肝素抗凝血液 -大量研究表明外周血DNA与肿瘤组织标本DNA的EGFR基 因型的吻合率为76%91%（ Jon et al. J Clin Oncology 26(35),2008 -适用于：NSCLC晚期患者不能手术治疗者,用药建议,EGFR基因19-21号外显子突变的 纯合子或杂合子病人，建议使用含吉非替尼、艾罗替尼的化疗方案可以取得较好疗效，显著延长期生存期；无突变者不推荐使用酪氨酸激酶抑制剂。,EGFR 突变检测报告,肿瘤靶向性药物个体化治疗,三、胃肠间质瘤与c-Kit基因突变检测,胃肠间质瘤 （gastrointestinal stromal tumors, GIST）,胃肠道最常见的肉瘤： -间叶源（结缔组织）性肿瘤 -占胃肠道肉瘤的80% GIST年发病率为14.5/100万，患病率为129/100万。 1993年发现CD34为免疫组化标记物，1998年发现CD117为高特性标记物，并发现c-Kit基因突变。,GIST的免疫表型,GIST中KIT的阳性染色（膜和胞浆以及核旁点状浓集）,约95%的GIST c-Kit (CD117)阳性。 GIST中其它阳性指标： -CD34(间叶/造血祖细胞标记物），阳性率60-70%。 -平滑肌动蛋白，阳性率15-60%。 - S-100，阳性率10%。 GIST偶尔表达结蛋白。,c-Kit受体,家族功能获得性c-Kit突变导致GIST、黑色素细胞功能障碍和皮肤肥大细胞增多症的发病率增高,c-Kit受体：CD117、干细胞因子受体(SCFR)、肥大细胞生长因子受体(MGFR） 受体结构： 位于细胞膜上，为型酪氨酸激酶受体。细胞外有与配体干细胞因子（SCF）结合区域。细胞胞内区包括： 2个酪氨酸激酶区和多个自身磷酸化位点。 生理活性：KIT受体与干细胞因子结合后被激活（磷酸化），导致磷酸化级联反应，能够调节凋亡、细胞分化、增殖、趋化以及细胞黏附。,GIST治疗现状,手术切除可能治愈，但复发转移率高（55%-90%） 放射治疗不敏感，RR5%。 传统全身化疗：无效或10%，未延长OS。 支持疗法不能控制病情进展。,目前内科药物治疗主要采用靶向性药物: -伊马替尼（Imatinib,格列卫），为复发、 转移GIST的标准一线治疗药物 -舒尼替尼,伊马替尼作用机制,伊马替尼作用于c-Kit蛋白，与c-Kit蛋白结合，占据了ATP在激酶区的结合位点。 阻止底物的磷酸化及信号传导。 信号传导阻滞，抑制了细胞的增殖与存活。 可作用于多靶点: -除c-Kit外，还有c-Ab1、Bcr-Ab1和PDGFR。,KIT基因突变,Heinrich et al. Hum Pathol 2002;33:484.,c-Kit基因突变对伊马替尼敏感性的预测,c-Kit,c-Kit基因突变与无事件生存时间（率）,c-Kit基因突变与总