厌氧培养简介标本采集和运送和鉴定课件

第十五章 厌氧菌 (anaerobic bacteria) 临床微生物学免疫学教研室 李闻文 2007,9,目的要求 1.掌握厌氧菌概述 2.熟悉检验 3.掌握破伤风杆菌和产气荚膜杆菌,一、 厌氧菌的概念、形态与分布 厌氧菌是指一大群在有氧条件下不能生长，必须在无氧条件下才能生长的细菌。主要可分为两大类，一类是有芽胞的革蓝阳性梭菌，另一类是无芽胞的革蓝阳性及阴性杆菌与球菌。医院常规方法培养不能检出。抗菌治疗也多无效，是临床上许多疑难杂症。如无菌性感染或脓肿, 原因不明的发热。,第一节 概 述,某些感染性疾病迁延不愈和反复发作。容易造成感染性疾病漏诊和误诊，由于厌氧培养技术的改进，无芽胞厌氧菌大大多于有芽胞厌氧菌，占90%。 厌氧菌分布十分广泛，是体内正常菌群的组成成员，多为条件致病菌。感染遍及临床各科，且多为混合感染。对氨基糖甙类抗生素耐药，而对甲硝唑普遍敏感。,1986年，将厌氧菌分31属,245个种和亚种，近20年来新的发现增至40多个菌属，300多个菌种和亚钟，而有芽胞厌氧菌只有一个梭菌属,共130个种。,厌氧菌广泛分布于自然界和人体中，梭状芽胞杆菌以芽胞的形式在自然界长期存活。无芽胞厌氧菌存在人和动物体内，口腔，肠道，上呼吸道，尿生殖道。与需氧菌，兼性厌氧菌构成正常菌群。如肠道中厌氧菌占99.9%。如1克大便1000亿个，如大量使用广谱抗生素，机体免疫力下降，进入非正常部位，作为条件致病菌，引起内源性感染。,临床意义 由厌氧菌感染在人类感染疾病中占相当大的比例，如脑脓肿，牙周脓肿，口腔脓肿80%以上由厌氧菌引起，可以是单独，也可与兼性厌氧菌或需氧菌混合感染。,（一）厌氧菌感染的条件 组织缺氧或氧化还原电势降低均可造成厌氧菌生长繁殖的适宜环境，易遭受厌氧菌感染，原因很多，如局部组织供血障碍，见于血管损伤，肿瘤压迫，烧伤，动脉硬化，组织水肿，梗死，有异物。大面积烧伤，刺伤亦可。,机体免疫功能下降易并发厌氧菌感染，如免疫抑制剂、放疗、化疗。 一些慢性疾病导致免疫功能不足或受损易并发厌氧菌感染。如糖尿病患者，慢性肝炎，肾病炎，开放性骨折，各种大型手术，老年人，早产儿。滥用抗生素也是一个方面。,厌氧菌进入适当的生长繁殖部位，大量繁殖和损伤组织。坏死组织吸收余氧，进一步降低氧化还原电势，更有利于繁殖，产生内、外毒素，侵袭性酶、酸类、气体及其他毒性产物，造成组织进一步损伤、坏死和全身中毒。 在厌氧感染中，大部伴有需氧或兼性厌氧菌感染,（二）厌氧菌感染的临床及细菌学特征 凡有下列情况者应怀疑有厌氧菌感染 1. 感染组织局部产生大量气体，造成组织肿胀和坏死，皮下有捻发感，是产气荚膜梭菌感染的特征。 2. 发生在黏膜附近的感染，如：口腔，肠道，鼻咽腔，阴道有大量厌氧菌感染。如果这些部位及邻近部位破损易发生感染。 3. 深部外伤或被动物咬伤可能发生厌氧菌感染,4分泌物有恶臭，或为血红色并在紫外光下发出红色荧光，都可能是厌氧菌感染。产黑色素普鲁梭菌和不解糖紫单胞菌其分泌物发红色荧光，放线菌感染的分泌物或脓肿中有硫磺颗粒。 5分泌物镜检阳性，常规培养阴性，或在液体，半固体培养基深部有细菌生长。 6长期应用氨基糖甙类抗生素治疗无效的病例。 7最近有流产史，以及胃肠手术后的感染。,第二节 厌氧性细菌的检查 一、 标本的采集和运送 标本的采集和运送是否适当，对厌氧菌培养成功很重要，要注意的二点：一是不能被正常菌群污染，二是不能接触空气。 （一） 标本的采集方法 应从无正常菌群部位采集标本，无菌操作抽取无菌液体，包括血液，关节液，心包液，胸腹腔液，膀胱穿刺液，深部脓肿，其他组织穿刺液等。,在正常情况下厌氧菌可寄生于皮肤和粘膜，不一定是真正的致病菌，下列标本无送检价值，不宜做厌氧培养： （1）鼻咽拭子 （2）齿龈拭子 （3）痰和气管抽取物 （4）胃和肠道内容物，肛拭 （5）接近皮肤和黏膜分泌物 等。,经皮肤粘膜采集标本时，局部消毒，多使用针管抽取，减少与空气接触的机会，抽取时穿刺针头应消毒刺入病变部位，一般抽34ml,若病变液体少，先抽取还原液或还原肉汤注入病变部位，再抽取。,（二）标本的运送与处理 核心问题是避免杂菌污染及空气接触 1针筒运送法 主要指液体标本，抽取后排除空气，针尖插入无菌橡皮塞。 2无氧小瓶运送法 通常运送少量脓液，用无菌青霉素小瓶作采样瓶，瓶内装培养基及少量指示剂。密封，抽出空气，充以CO2，灭菌备用，再加入标本。 3棉拭运送法少用，用无菌试管装上，试管可加入还原剂培养基密封。,4 大量液体运送法 装满密封。 5 组织块运送法 组织块放在密封的罐内，并加还原剂。 6 厌氧袋运送法 袋经还原剂处理，将平板带到病人床边。 标本到达后，应在30min内处理完，最多不超过小时。如果办不到，应置室温。因低温对厌氧菌有害，而且低温时氧的溶解度高。故每次接种时应观察标本的性状，详细记录。,二、检验程序,三、检验方法 （一） 直接镜检 除血液外，各种标本必须在接种前摇匀后，革蓝染色。观察细菌的形态和染色性，可估计菌量。肉眼与显微镜相结合，作出初步估计。选择培养，进一步检查及时用药。如标本发臭，镜检发现染色不均，形态奇特者常为厌氧菌的表现。为初步鉴定和进一步鉴定起指导作用。,（二） 分离培养 1初代培养 比较困难，不仅要有一个与人体内感染部位相似的无氧环境，而且还要选择适当的培养基。 （1）培养基的选择，根据镜检结果可选择以 下培养基 1） 强化血琼脂平板（BAP），布氏琼脂或牛心、牛脑浸出液琼脂为基础培养基，补加酵母浸膏，动物血，维生素K及氯化血红素，适应所有厌氧菌。 2）卡那-万古霉素冻溶血琼脂平板（KVLB）适于产黑色素普雷沃菌。,3） 七叶苷胆汁平板（BBE） 适于脆弱类杆菌、可变梭杆菌、死亡杆菌，如培养时间延长肠球菌也能生长。 4）卵黄平板（EYA）和兔血平板，适于产气荚膜杆菌。 还有很多培养基在接种前必须处无氧状态。一般当天配制或放在充以C02的容器内，4保存2天，液体培养以煮沸去氧。,（1） 标本的接种 培养的菌通常接种几种培养基，如需氧、兼性厌氧、微需氧、厌氧培养基。如仅作厌氧培养，应选择一种或几种选择培养基。（为了在混合培养物中发现厌氧菌，在培养表面贴含甲硝唑纸片） （2） 厌氧培养方法 经接种的培养基立即放入无氧容器进行培养，常用的方法有 厌氧罐培养法：使用密封的罐子，应用物理或化学方法造成无氧环境，常用的方法有：,冷触媒法：利用气体发生器产生氢及C02，在触酶作用下，氢与氧结合生成水，消耗了氧。 抽气换气法：罐内放有触酶1020粒。将培养物放入后，密闭通过活塞将空气用真空泵抽尽，充入氮气，重复二至三次。,钢末法：将钢丝绒、钢末浸入酸性硫酸铜溶液中，其表面形成一层金属铜，这种铜铁结合物极易吸收氧而被氧化。使罐内无氧。 以上有指示剂美蓝，无氧为白色，有氧为蓝色。,气袋法：其原理与厌氧罐雷同。 厌氧手套箱法：是一种特制的操作培养箱 其它培养法：在一些基层单位，缺乏特殊仪器设备，提供一些简易方法。如平皿焦性没食子酸法、生物耗氧法、疱肉培基法、液体培养法、高层琼脂培养法。 大多厌氧菌初代培时间长，至少48hr.放线菌7296hr。,2次代培养和厌氧菌的确定 标本培养48 hr以后，每个平板挑5个不同性状菌落，每个菌落分别接种23个平板。每个平板划分46个区。然后放入有氧、无氧和含5%10%二氧化碳环境中培养48hr。如在有氧、无氧中都能生长为兼性厌氧菌。如均不生长或生长不好为需C02菌。有氧下生长，无氧下不生长为需氧菌，反之为厌氧菌。,（三） 鉴定试验 根据菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性等作出初步鉴定。最后鉴定是一系列生化及终末代谢产物。 1形态与染色 仅供参考，因不同培养基，不同菌龄其形态与染色性不同，厌氧培养时间往往较长，因有的G变为G。 2菌落性状 不同厌氧菌菌落形状和性质不同，梭菌的菌落特点是形状不规则，而无芽胞厌氧菌多呈单个的圆形小菌落。,（1） 色素：产黑色素普鲁沃菌培养210天可产生黑褐色或黑色色素，龋齿放线菌培养34天后产生粉红色色素，奈氏放线菌延长培养时间可产生黄褐色色素。 （2） 溶血：产气荚膜梭菌在新鲜血平板上可形成双溶血圈，但同种的菌不同株则往往产生溶血性的差异，各细菌产生的溶血毒素不同，对不同动物红细胞溶解亦有差异。 （3） 荧光：产黑色素普鲁沃菌，菌落在紫外线照射下，发出砖红色荧光，梭杆菌常发生黄绿色荧光，艰难杆菌发生绿色荧光。 3. 耐氧试验 厌氧菌必须做耐氧试验,4. 药物鉴定试验 大多数类杆菌对卡那霉素耐药，梭杆菌属敏感，厌氧菌对灭滴灵敏感，非厌氧菌耐药。 5. 聚茴香脑磺酸钠（SPS）敏感试验 厌氧消化链球菌对50g/L的SPS溶液敏感，而绝大多数其它G球菌耐药 6. 生化特性 主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂肪酶试验、蛋白溶解试验、明胶液化试验、胆汁内肉汤生长试验、硫化氢试验，其方法多种多样。,7. 气液相色谱 气液相色谱技术（GLC）是一种以气体或液体为流动相，以涂固定液的载体为固定相。采用冲洗法的柱色谱分离技术。目前用来分析细菌终末代谢产物，结果可靠。 8PCR、基因探针。,（四）检验结果分析与报告 根据革兰染色镜检、菌落性状、耐氧试验若发现厌氧菌可初步报告“检出厌氧菌，形似菌”。再根据生化反应及终末代谢产物作最终报告。分离鉴定什么菌及药敏试验结果。,第六节 梭状芽胞杆菌属 厌氧芽胞杆菌(anaerobic sporeforming bacilli)只有一个属，简称梭杆菌属(Clostridum)，130个种，G但在陈旧培养物中G，芽胞正圆形或卵圆形，直径大于菌体横径，位于菌体中央、极端或次端，使菌体膨大呈梭状而故名。本菌属在自然界分布广泛，常存在于土壤、人和动物肠道及腐败物中，多数为腐物寄生菌。其中不少菌可用于生物工程技术，发酵商业和工业所需的有机溶剂、酸类，少数为致病菌，能分泌外毒素和侵袭性酶类，可使人和动物致病。,一、破伤风梭菌 (C.tetani) （ 一） 临床意义 广泛存在于自然界，在人和动物肠道肠道中都存在。当机体受伤或新生儿不清洁断脐时，引起机体强直性痉挛、抽搐，称为破伤风。全世界每年有100万病例发生，病死率20%。新生儿破伤风又称脐带风，病死率高达90%。,本菌主要是感染方式是通过创伤，如烧伤、外伤切口缝合，特别是深而窄的伤口，夹有泥土，局部坏死，组织多伴有其他化脓性感染，造成局部组织氧化还原电势降低，细菌繁殖产生毒素，细菌本身不侵入血流。该毒素对脊髓前角运动细胞有高度的亲和力，与神经节苷脂结合，封闭了脊髓抑制触突，从而阻止了抑制性触突未端释放抑制性冲动的传递介质。,出现屈肌收缩伸肌也收缩，即痉挛。初期有轻度发热、头痛、不适、肌肉酸痛等前驱症状，随后局部肌群抽搐、咀嚼肌和表情肌痉挛、张口困难、牙关紧闭、苦笑面容。继后颈部躯干及四肢肌肉发生强直性痉挛，角弓反张。全身颤抖、呼吸困难、窒息死亡。,（二） 微生物特性 1形态与染色 菌细长，有周鞭毛，无荚膜，芽胞正圆形，大于细胞横径，位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状，G。,2. 培养特征 为专性厌氧菌，在普通培养基上不易生长，在血平板上37培养48h见薄膜状爬行物生长。伴溶血。不易获得单个菌落。如在疱肉培养基，肉渣部分消化，微变黑。有少量气体。生成甲醛硫醇及H2S，有腐败性恶臭味。培养几天后，培养液有时变清，这是菌体自溶所致。,3. 生化反应 不发酵糖类，能液化明胶，产生H2S，形成吲哚，对蛋白质有微弱消化作用，气液相色谱可检出的代谢产物有乙酸、丙酸、丁酸和丁醇。,4. 抗原构造 有O、H抗原，H抗原有型特异性，O无。根据鞭毛抗原不同，可分为10个血清型，各型所产生的毒素的生物活性和免疫活性相同。 5. 抵抗力 繁殖体抵抗力与其它的菌相似，但芽胞抵抗力很强，在土壤中存活数年至数十年。煮沸100 1h被杀死，对青霉素、红霉素、四环素敏感。,（三） 微生物检验 破伤风的临床症状比较典型，一般不需要实验室检查。如果需要试验结果， 可按下列方法进行 1. 直接涂片 从病灶处取脓汁或坏死组织，直接涂片G染色，G鼓槌状杆菌。,2. 厌氧培养 可疑材料接种疱肉培养基75 85水浴加热30min，杀灭其它杂菌，芽胞存活，35 37培养2 4天，呈薄膜状迁徙生长，边缘扩散，常为平板的1/2 2/3，要获得纯培养。有时需2 3次转种。加硫酸新霉素可抑制其它厌氧菌的生长。,3.毒力试验 有毒力试验和毒力保护试验。前者是在小白鼠尾根部皮下0.1 0.25ml培养滤液，阳性出现尾部僵直竖起、后腿强直或全身肌肉痉挛至死亡；后者是将培养液与破伤风抗毒素混合注射不发病。,4.鉴定 一般取伤口分泌物作涂片镜检，其典型鼓槌状菌体有鉴定意义。必要时进行细菌培养，并用动物保护试验作最后鉴定。有条件时，可用气液相色谱检测其主要代谢产物协助早期快速诊断。,（四） 检验结果分析与报告 一般取伤口分泌物涂片、染色，如见到典型的G鼓槌样菌。即可报告要检出破伤风菌。如标本直接涂片、镜检，菌体形态不典型或量少，难以判定时，可进行分离培养、动物试验，阳性者报告“经天培养出破伤风梭菌和破伤风抗毒素阳性”。,二、产气荚膜梭菌（C.perfringens） （一） 临床意义 因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，影响血液供应，造成组织大块坏死。,本菌可产生外毒素及多种侵袭性酶类。外毒素有、等12种。各有不同的毒性作用，其中最重要的毒素，为卵磷脂酶，引起溶血、组织坏死和血管内损伤，使血管道通透性增高造成水肿。同时毒素还能促使血小板凝聚，血栓形成，局部组织缺血。毒素可引起人类坏死性肠炎。毒素有坏死和致死作用。毒素有溶血和破坏白细胞的作用，对心肌有毒性作用。,该菌的致病条件与破伤风芽胞梭菌相同，主要是大面积创伤，局部供血不足。此时组织缺氧坏死，氧化还原电势下降，芽胞发芽繁殖，产生毒素和侵袭性酶，引起感染致病。主要是气性坏疽，是外伤特别是战伤截肢的主要原因。有些型别也可引起食物中毒和坏死性肠炎。常与厌兼性厌氧菌混合感染，引起深部脓肿、败血症、心内膜炎及其它腔道感染。,（二） 微生物特性 1形态与染色 G粗短大杆菌，两端钝圆，单个或成双排列，芽胞椭圆形。位于菌体中央或次极端，直径不大于菌体横径，在无糖培养基中有利形成芽胞。在机体内产生明显的荚膜。,2培养特征 厌氧，但要求不严格，繁殖迅速，培养24h后，在液体培养基深层有明显生长。46后出现表面生长。固体培养基上24h菌落直径24mm，圆形、凸起、光滑、半透明、边缘整齐，无迁徙生长现象。在血平板上有双层溶血环，内环完全溶血，毒素的作用；外环不完全溶血由毒素引起。,在蛋黄琼脂平板上，菌落周围出现乳白色混浊圈，是由细菌产生的卵磷脂酶分解蛋黄中的卵磷脂，这一现象称为Nagler反应，能被特异性抗体所中和。 在疱肉培养基中产生气体，肉渣呈粉红色，不被消化。,在牛乳培养基中能分解乳糖产酸产气，使酪蛋白凝固，气体将凝固的酪蛋白冲成蜂窝状。并将液面上的凡士林向上推挤，甚至冲开管口棉塞，气势凶猛，称为“汹涌发酵”（stormy fermentation）。,3. 生化反应 发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖，产酸产气，不发酵甘露醇或水杨苷，液化明胶，产生H2S，不能消化已凝固的蛋白质和血清，吲哚阴性，主要代谢产物为乙酸和丁酸，有时有丁醇。 4. 分型 根据产生外毒素种类不同，分为A B C D E五个型,对人致病的主要是A、C，A型最常见，引起气性坏疽和胃肠炎型食物中毒。C型引起坏死性肠炎。,（三） 微生物检验 1检验程序 包括直接涂片镜检、厌氧培养、然后挑取可疑菌落镜检、汹涌发酵试验、生化反应、动物试验等。 2标本的采集 一般取创伤深部的分泌物、穿刺物、坏死组织块,菌血症时期的血液，可疑食物，其中坏死组织应研磨成悬液。,3标本直接检查 G粗大杆菌，伴有其它杂菌，白细胞较少形态不规则，是气性坏疽直接涂片的特点，对早期诊断及时防治有重要意义。,4 分离培养与鉴定 （1） 厌氧培养 本菌可耐受耐低