[农学]第11章 核酸合成.ppt

2019/5/7,1,第11章 核酸的生物合成,第一节 DNA的生物合成 第二节 RNA的生物合成,2019/5/7,2,主要内容： DNA复制：DNA复制的半保留方式；DNA复制的起始点和方向；DNA复制的酶类和蛋白质；DNA复制的基本过程； DNA的修复：DNA的损伤修复，突变； RNA的生物合成：不对称转录；RNA聚合酶；转录过程；转录后加工过程； RNA复制和逆转录：RNA复制；逆转录； 重点：1.DNA复制；2. 转录； 难点：DNA复制和转录过程。,2019/5/7,3,DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序(三联体密码)，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。,DNA是生物遗传的物质基础遗传信息的载体,2019/5/7,4,中 心 法 则,1964-1970 劳氏肉瘤病毒的 遗传方式 致癌RNA病毒、植物RNA病毒,1958年，遗传信息的单向,遗传信息的传递,2019/5/7,5,复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所 含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。 逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。,2019/5/7,6,第一节 DNA的生物合成,DNA的复制（DNA指导下的DNA合成） 逆转录（RNA指导下的DNA的合成） DNA 突变 DNA的损伤与修复(修复合成),2019/5/7,7,DNA的存在形式 染色体与质粒,严紧控制质粒,单拷贝质粒： 每个细胞内只有一个或少数几个拷贝,松弛控制质粒,多拷贝质粒： 每个细胞内含有许多拷贝（20以上）,1 DNA的复制,2019/5/7,8,病毒与细菌的DNA,2019/5/7,9,真核细胞的染色体,2019/5/7,10,1.1 DNA的半保留复制 (一) 定义和实验证据：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。,半保留复制的实验证据: 1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。,2019/5/7,11,细胞在15N标记培养基中（NH4Cl）连续培养15代，使所有DNA分子均标记上15N，转入14N标记的培养基,CsCl密度梯度离心 浮力密度 15NDNA 1.742g/ml 14NDNA 1.710g/ml 15N/ 14NDNA 1.717g/ml,2019/5/7,12,原核细胞DNA的半不连续复制复制过程,复制叉的移动方向,3,5,3,5,复习,2019/5/7,13,DNA的半保留复制的生物学意义：,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。 DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质:在细胞内外各种物化因子均可导致DNA损伤，需要修复；在复制和转录过程中DNA会发生损耗，必须进行更新；在发育和进化过程中DNA可能进行修饰、删除、扩增和重排；在进化的角度上，DNA更是处在不断的变异和发展中。,2019/5/7,14,1.2 复制起点、方向和方式,1.2.1复制起点（origin ， ori或 o ， 复制原点）,原核生物染色体DNA（或真核生物的细胞器DNA） 单复制起点，即整个染色体只有一个复制单位。,真核生物染色体DNA : 多复制起点 一个genome中有多个复制单位,复制起点：复制开始处DNA分子的特定位置 复制子(Replicon)（复制单位 ）：从一个起点到一个终点所包含的DNA区域，是基因组独立进行复制的单位。,许多生物的复制起点都是富含A、T的区段,2019/5/7,15,复制叉（Replication fork）：DNA复制进行时，在眼的两侧出现两个叉子状的生长点(growth point)，叫复制叉。在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为复制体（replisome） 大多数复制是双向的，形成两个复制叉；,复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛,1.2.2 复制方向及方式,2019/5/7,16,复制方式,双向复制(bi-directional) ： 大多数复制从起点开始向2个方向复制 2个复制叉(replication fork),单向复制(unidirectional) ： 少数复制从起点向1个方向复制 1个复制叉或生长点(growing point),2019/5/7,17,真核染色体DNA 线环状双链,E .coli染色体DNA 环状双链,2019/5/7,18,1.3 与DNA复制有关的酶和蛋白质,1.3.1 DNA聚合酶 1.3.2拓扑异构酶 1.3.3 DNA解旋酶 1.3.4单链结合蛋白 1.3.5引发酶及引发体 1.3.6 DNA连接酶 目前已发现30多种酶及蛋白质因子参与DNA复制,2019/5/7,19,1.3.1 DNA聚合酶(DNA polymerase):延长子链,DNA聚合酶不能从头合成子链，只能延长 DNA聚合酶：多种类、多种活性,2019/5/7,20,2019/5/7,21,1）DNA聚合反应条件,（1）底物 dNTP（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）,（2）聚合酶,（3）模板 单链的DNA母链,（4）引物 寡核苷酸引物（RNA),（5）其他：解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶,2019/5/7,22,2）聚合机制,（1）DNA聚合酶： 5 3的聚合活性,需引物链,2019/5/7,23,（2）DNA聚合酶：核酸外切酶活性 35外切酶活性 53外切酶活性,2019/5/7,24,在大肠杆菌中发现主要有三种DNA聚合酶，分别为： DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶,E.coli DNA聚合酶,DNA聚合酶IV和V：1999年发现，当DNA严重损伤 时，诱导产生。,2019/5/7,25,原核生物中的DNA聚合酶,在大肠杆菌中发现有三种DNA聚合酶（用突变株研究其功能）： DNA聚合酶:单体酶,多肽链内含一个锌原子（其鳌合剂是O-二氮杂菲），多功能酶。它具有5 3 聚合酶功能（对脱氧核苷酸的选择）； 3 5 外切酶活性（对双链无作用，校对功能。但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链）及5 3外切酶活性（双链有效，主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其空隙的填补）；在DNA链的3 形成焦磷酸解（生理意义不大）；无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。 DNA聚合酶：多亚基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有3 5外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。,2019/5/7,26, DNA聚合酶：是原核生物DNA复制的主要聚合酶，该酶由10种亚基组成，其中、形成全酶的核心酶。具有5 3 DNA聚合酶活性（ 亚基，速率高）； 具有3 5外切酶（亚基）的校对功能，提高DNA复制的保真性；还具有5 3外切酶活性（单链有效，其意义未知）。 （4） DNA聚合酶IV和V：1999年发现，当DNA严重损伤时，诱导产生。,2019/5/7,27,DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 亚基数目 1（单体酶） 多亚基酶 多亚基酶 53 聚合活性 + 中 + 很低 + 很高 3 5 外切活性 + + + 5 3 外切活性 + ,2019/5/7,28,拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。,拓扑异构酶：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。 二者共同控制DNA的拓扑结构。,1.3.2 拓扑异构酶： 催化DNA的拓扑链环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其他转变方面起重要作用。 除链环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶(Topo，解超螺旋酶),2019/5/7,29,Topo ： 切开DNA中的一条链，与另一 条链解缠绕或再缠绕连接,Topo 同时切开DNA双链 解旋或再螺旋连接,2019/5/7,30,本质：切断DNA磷酸二酯键 改变DNA的链环数，再连接 兼具DNA内切酶、连接酶的性质,断裂、连接反应相互耦联 不能连接事先已经存在的断裂DNA,2019/5/7,31,2019/5/7,32,2019/5/7,33,1.3.3 解螺旋酶 （解链酶）：通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。,1.3.4 单链结合蛋白(SSB-single-strand binding protein)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。,2019/5/7,34,1.3.5 引发酶及引发体,引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n、n 和i组成。 引发酶：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。,引发体可以沿模板链53方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。 移动和引发均需要ATP提供能量，引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。,以DNA为模板合成一段RNA, 作为合成DNA的引物。,2019/5/7,35,DNA中一条链有切口，切口一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，使切口连接。不能将两条游离的DNA单链连接起来。,1.3.6 DNA连接酶,大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能在模板链上连接DNA和DNA链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链DNA。,2019/5/7,36,2019/5/7,37,连接酶的反应机制： 酶 + NAD+(ATP) 酶-AMP + 烟酰胺单核苷酸（PPi） 酶-AMP + P-5-DNA 酶 + AMP-P-5-DNA DNA-3-OH + AMP-P-5-DNA DNA-3-O-P-5-DNA+AMP DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用,2019/5/7,38,酶-AMP,AMP-P-5-DNA,磷酰胺键,以焦磷酸活化磷原子,2019/5/7,39,拓扑异构酶,解链酶,单链结合蛋白,DNA聚合酶,引物酶及引发体,DNA连接酶,引物,DNA双链,DNA复制有关的酶和蛋白质,2019/5/7,40,拓扑异构酶,解链酶,单链结合蛋白,DNA聚合酶,引物酶及引发体,DNA连接酶,引物,拓扑异构酶 与DNA双链 结合，解开 超螺旋。,DNA复制有关的酶和蛋白质,2019/5/7,41,拓扑异构酶,解链酶,单链结合蛋白,DNA聚合酶,引物酶及引发体,DNA连接酶,引物,解链酶解开 DNA双螺旋,DNA复制有关的酶和蛋白质,2019/5/7,42,拓扑异构酶,解链酶,单链结合蛋白,DNA聚合酶,引物酶及引发体,DNA连接酶,引物,单链结合蛋白防止复螺旋,DNA复制有关的酶和蛋白质,2019/5/7,43,拓扑异构酶,解链酶,单链结合蛋白,DNA聚合酶,引物酶及引发体,DNA连接酶,引物,引物酶合成引物,DNA复制有关的酶和蛋白质,2019/5/7,44,1.4 DNA的半不连续复制,1968年由冈崎通过实验证明 DNA复制是半不连续的,2019/5/7,45,1.4.1 冈崎片段的发现（1968）： 同位素实验，3HdT 短时间内为DNA小片段一段时间后检测到 DNA大片段。当用DNA连接酶的变异株时，检测到大量DNA片段的积累 证明DNA复制中有小片段合成。 由于U替代dT，被尿嘧啶-DNA-糖苷酶切除。测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。 在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。,后两个实验表明：在DNA复制时只有一条链是不连续的！,2019/5/7,46,领头链在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链（前导链）。 随后链在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链（滞后链）。这些不连续的片断，称为冈崎片断。每个冈崎片段的合成也都需要引物。 冈崎片段：真核生物中100-200个核苷酸（核小体的DNA单位）。原核生物中1000-2000个核苷酸。 半不连续复制（semidiscontinuous replication）在DNA复制时，领头链是连续合成的,而随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。,2019/5/7,47,1.4.2 半不连续复制,2019/5/7,48,冈崎片段合成后由DNA聚合酶切除RNA引物并催化合成一段DNA填补留下的空隙。 再由DNA连接酶把他们连成一条完整的子代链，称为滞后链。,2019/5/7,49,1.5 E.coli.染色体DNA复制过程,起 始 延 伸 终 止,2019/5/7,50,1.5.1复制的起始,2019/5/7,51,大肠杆菌复制的起点由245个bp构成，其序列 很保守，有两组短的重复： 3个13 bp的序列和4个9 bp的序列,2019/5/7,52,20个DnaA结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。 三组13bp重复区依次变性，产生开放型复合物。 DnaB（解螺旋酶）在DnaC协助下与开放复合物结合，进一步解链。 解链时带来的扭曲张力还需DNA旋转酶（属DNA拓扑异构酶）引入负超螺旋消除。,2019/5/7,53,单链结合蛋白( SSB）结合在单链区，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解 引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子构成的复合体（引发体），以DNA为模板合成RNA引物（ 6-10个碱基）引发,2019/5/7,54,在DNA的复制原点，双股螺旋解开，成单链状态，分别作为模板，合成其互补单链。,解链,2019/5/7,55,引发体在复制叉上移动，识别合成的起始位点， 引发RNA引物的合成。领头链先引发开始合成，以原来一条DNA单链为模板（3 5),按5 3的方向合成一段RNA引物链。领头链开始合成后，随后链也开始合成其引物。在引物的3端为游离的羟基。,RNA引物合成,DnaB蛋白活化引物合成酶。引物长度约为几个至10个核苷酸，与复制叉移动的方向相同， （引物酶的底物是核苷三磷酸） 5端含3个磷酸残基，,2019/5/7,56,大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质,SSB,解链酶,引物,引物酶,拓扑异构酶,2019/5/7,57,在DNA聚合酶的催化下，以脱氧核糖核苷酸为底物，在RNA引物的3端加上脱氧核糖核苷酸。,1.5.2 DNA链的延伸,2019/5/7,58,DNA链的延伸,2019/5/7,59,延 伸,前导链只需要一个RNA引物，随后链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物。 链的延长反应由DNA pol.催化。 复制体：在DNA合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制。,2019/5/7,60,、和三种亚基组成核心酶,核心酶形成二聚体 -亚基犹如一个夹子夹住DNA分子，并向前滑动，使DNA聚合酶在完成复制前不再脱离DNA,2019/5/7,61,复制体沿着复制叉方向前进，同时进行前导链和滞后链的合成。 一分子的 DNA pol III. 协同合成前导链和滞后链，因此滞后链必须绕成一个突环。,2019/5/7,62,1.5.3 DNA合成的终止,E.coli 有两个终止区域，分别结合专一性的终 止蛋白 tus 序列一：terE terD terA 序列二：terF terB terC 共6个终止位点。,每个区域只对一个方向的复制叉起作用 Tus蛋白-ter复合物阻止一个方向的复制叉前移(通过抑制DNA解旋酶而发挥终止作用),2019/5/7,64,终 止,两个复制叉向前移动，最后在终止区相遇并停止复制，由DNA聚合酶填补空隙，最后由连接酶封口。结果形成两个DNA双股螺旋分子。,2019/5/7,65,原核细胞DNA的半不连续复制复制过程,复制叉的移动方向,3,5,3,5,2019/5/7,66,1.6真核生物染色体DNA的复制,1.6.1真核和原核DNA复制比较,、 、 、 、 负责核DNA的复制 负责线粒体DNA的复制,较慢,较快,2019/5/7,67,在真核细胞内有五种DNA聚合酶 （与细菌DNA聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向） 定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核 3-5 外切 - - + + + 酶活性 功能,引物 合成,修复 作用,线粒体DNA 的复制,核DNA 的复制,修复 作用,2019/5/7,68,1.6.2 真核生物中DNA的复制特点,1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。 2、冈崎片段长约200bp. 3、真核生物DNA复制速度比原核慢。 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。 5、真核生物有多种DNA聚合酶。 6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5端RNA引物切除后的填补，以保持端粒的一定长度。,2019/5/7,69,真核生物染色体DNA复制过程中 组蛋白的装配,核小体的结构（200bp左右） 在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个打开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此，DNA的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。,2019/5/7,70,1.6.3真核生物染色体DNA末端复制的问题,真核生物线状染色体在复制最后，5末端RNA引物被切除后，无法向原核那样填补空缺，如果没有特殊的机制合成末端序列，将造成5 末端序列缩短，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。 通过端粒酶催化形成端粒结构来解决,原核生物染色体DNA是环状的，其随后链的5最末端冈崎片断的RNA引物被切除后可借助另半圈DNA连向前延伸来填补，,2019/5/7,71,端粒酶是含RNA的逆转录酶,端粒酶与细胞老化有关,端粒（telomeres） ：是真核细胞染色体末端所特有的结构，有许多串（1000串或更多）短的重复序列组成，通常3末端链是富含G的短序列。,端粒酶:含有RNA和蛋白质（起DNA聚合酶的作用）两种组分，RNA分子约150b，含有与重复端粒结构互补的一个片断，可作为端粒链合成的模板。,2019/5/7,72,1.7 确保DNA复制忠实性的机制,1、采用DNA聚合酶催化聚合反应 2、依赖DNA聚合酶核酸外切酶活性 3、使用RNA引物 4、依赖核苷酸代谢库调节系统(保证dNTP的正常水平),多种修复系统,2019/5/7,73,1.8 DNA复制的其它方式,大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制） 真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制） 单向滚环式复制（噬菌体X174DNA单链环状）,D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步；或同步为2-D环）,切开正链，以负链 为模板开始复制,2019/5/7,74,2.1 DNA的损伤,某些理化因子（紫外线、电离辐射和化学诱变剂等）作用于DNA，造成其结构和功能的破坏，从而引起生物突变和致死的效应DNA的损伤,常见的DNA损伤方式嘧啶二聚体的形成,2 DNA的损伤与修复,2019/5/7,75,1、DNA分子的自发损伤,1）碱基错配： 尽管DNA聚合酶具有校对修复功能 仍存在极少量的错配（10-10）,2）自发性化学变化： 碱基异构 碱基脱氨基 脱嘌呤、脱嘧啶 碱基修饰 链断裂,3）物理因素引发的损伤,紫外线 电离辐射 DNA链断裂 交联,4）化学因素引发的损伤,烷化剂对DNA的损伤： 碱基烷基化、碱基脱落 断链、交联 碱基修饰剂、类似物对DNA的损伤 人工促变剂、抗癌药物 亚硝酸盐、黄曲霉毒素,2019/5/7,76,2、DNA损伤的后果,1）DNA分子的改变： 点突变、缺失、插入、倒位、易位、链断裂,2）DNA损伤的结果： （1）致死性 （2）丧失某些功能 （3）改变基因型而不改变表现型 （4）发生有利于物种生存的结果，生物进化,2019/5/7,77,2019/5/7,78,在一定条件下，生物体能使DNA的损伤得到修复:,暗修复,2.1光裂合酶修复 2.2切除修复 2.3重组修复 2.4诱导修复（SOS修复） 2.5错配修复,2.2 DNA的损伤,2019/5/7,79,光复活：400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上TT（CC CT）二聚体。（包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无） 切除修复：将DNA分子中的受损伤部分切除，以完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、DNA聚合酶、 DNA外切酶、DNA连接酶均参与。（发生在DNA复制前） 重组修复 （发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。P318 诱导修复：造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS response）。此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的DNA聚合酶。所以会有2种结果：修复或变异（进化）。,2019/5/7,80,光复合酶特异地和嘧啶二聚体结合,2.1DNA紫外线损伤的光裂合酶修复 （光复活作用直接修复）,酶被可见光激活,解聚二聚体后酶被释放,2019/5/7,81,2.2 切除修复,一般DNA的两条链只有一条受损伤，在一系列酶的作用下可将损伤部分切除，根据互补链的序列对其进行修复。,2019/5/7,82,2.3DNA的重组修复,是复制后的修复 DNA链的损伤并未除去 一直只存在母链上！若干 代后相当于被稀释。,胸腺嘧啶二聚体,2019/5/7,83,2.4SOS修复,为DNA的损伤所诱导，而产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的突变率（所以会有2种结果：修复或变异（进化） ，这属于倾向差错的修复。,2019/5/7,84,2.5 错 配 修 复 DNA在复制中发生错配，如果新合成的链被校对，基因编码信息可得到恢复；但如果模板链被校对，突变就被固定。,生物体内存在错配修复系统：能够识别“新” “旧”链！(依据甲基化),2019/5/7,85,3 DNA的突变,概念： DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。 产生： DNA在复制中可能产生错配，但自然条件下发生的突变率非常低 某些物理化学因素，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂（烷化剂、碱基类似物、嵌入染料）等,2019/5/7,86,自然条件下发生的突变成为自然突变，突变率非常低，能提高突变的物理或化学因子称为诱变剂。 碱基类似物(base analog）：5-溴尿嘧啶 碱基修饰剂(base modifier)：亚硝酸 嵌入染料(intercalation dye) ：吖啶橙、溴化乙锭 紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizing radiation,2019/5/7,87,诱变因素及突变类型,2019/5/7,88,碱基对的置换(substitution) 转换：两种嘌呤或两种嘧啶之间互换（常见） 颠换：嘌呤与嘧啶或嘧啶与嘌呤之间互换 移码突变(framesshift mutation),突变分子改变的类型,2019/5/7,89,转换,野生型基因,-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-,颠换,点突变（HNO2、NH2OH、烷化剂等）,插入或缺失1-2个碱基,2019/5/7,90,移码突变,由插入或缺失单个或2个碱基而改变整个基因序列、阅读框架的突变，称为移码突变。,2019/5/7,91,DNA的合成方式：,DNA的复制：以DNA为模板合成DNA。 逆转录：以RNA为模板合成DNA。 修复合成（DNA聚合酶I、连接酶、修复酶系统等）,2019/5/7,92,第二节 RNA的生物合成,转录（transcription）：以DNA的一条链为模板在RNA聚合酶催化下，按照碱基配对原则，合成一条与DNA链的一定区段互补的RNA链的过程称为转录。,2019/5/7,93,1958，Crick，中心法则,转录DNA指导下RNA的合成,2019/5/7,94,DNA复制：以DNA为模板合成DNA，遗传信息自上一代细胞向下 一代细胞传递,转录：以DNA为模板合成RNA，遗传信息自DNA转录至RNA分子,翻译：以mRNA为模板合成蛋白质，遗传信息表达至蛋白质,逆转录：以RNA为模板合成DNA（RNA病毒、真核细胞的端粒酶）,RNA复制：以RNA为模板合成RNA（RNA病毒）,2019/5/7,95,顺式作用元件,调节转录的DNA序列，如启动子、终止子、增强子,反式作用因子,可与顺式作用元件结合的调节蛋白；如启动转录因子、终止因子,RNA聚合酶,几个有关的概念,转录的主要酶，即依赖DNA的RNA聚合酶,加工,转录产生的RNA的切割、加帽、加尾和化学修饰 （如形成稀有碱基）,DDDP：依赖DNA的DNA聚合酶 DDRP：依赖DNA的RNA聚合酶,2019/5/7,96,转录的不对称性(asymmetric transcription)：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。 反义链（无意义链，负链）：在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。 有义链（编码链，正链）在RNA的转录中，不作为模板的DNA链称为有义链。,2019/5/7,97,转录产物：mRNA 、rRNA、 tRNA、各种小RNA 基因表达的产物:RNA和蛋白质 转录起始于DNA模板的一个特定位点，并在另一位点终止，此转录区域称为一个转录单位。 一个转录单位可以是一个基因（真核）单顺反子mRNA ，也可以是多个基因（原核）多顺反子mRNA 。,2019/5/7,98,1.1 E.coli RNA聚合酶：大肠杆菌的RNA聚合酶只有一种,全酶由5种亚基2 组成，另有两个Zn2+ 因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易与2 分离，没有、 亚基的酶称为核心酶只催化链的延长，对起始无作用。 五种亚基的功能分别为： 亚基：与启动子结合功能。 亚基：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯键。 亚基：在全酶中存在，功能不清楚。 亚基：与DNA模板结合功能。 亚基：识别起始位点。,2019/5/7,99,E.coli RNA聚合酶的特点：,反应底物：NTP(ATP/GTP/UTP/CTP)， DNA为模板、Mg2+促进聚合反应。 RNA聚合酶不需要引物，合成方向53 。,2019/5/7,100,1.2 E.coli RNA的转录过程： 起始位点的识别 转录起始 链的延伸 转录终止,2019/5/7,101,1.2.1起始位点的识别,RNA的合成不需要引物。体外实验证明，不含亚基的核心酶会随机地在一个基因的两条链上启动，当有亚基时就会选择正确的起点。 亚基起着识别DNA分子上的起始信号（启动子指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列）的作用。启动子的结构至少由三部分组成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；-10序列是酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）；第三部分是RNA合成的起始点。,2019/5/7,102,1.2.2转录起始,RNA聚合酶全酶扫描解链区，找到起始点，然后结合第一个核苷三磷酸。加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP，很少是CTP，不用UTP。完成最初的几个（2-9）核苷酸连接后，亚基就会被释放脱离核心酶。 所形成的启动子、全酶和RNA链复合物称为三元起始复合物。,因子仅与起始 有关，RNA的合 成一旦开始， 便被释放,2019/5/7,103,1.2.3 RNA链的延伸,DNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与DNA结合比较松弛，可沿DNA模板移动，并按模板顺序选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的RNA链的3-OH端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向从5 3,2019/5/7,104,RNA聚合酶催化的反应,A,C,G,A,C,G,U,U,模板DNA,5,3,新合成RNA,2019/5/7,105,1.2.4 转录终止（终止子和终止因子）,在DNA分子上（基因末端）提供转录停止信号的DNA序列称为终止子（terminators),它能使RNA聚合酶停止合成RNA并释放出RNA。（RNA聚合酶只能感受已经转录的信号序列）,终止因子，协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质）。终止因子因子能与RNA聚合酶结合但不是酶的组分，它的作用是阻止RNA聚合酶向前移动，于是转录终止，并释放出已转录完成的RNA链。,大肠杆菌有两类终止子： （1）不依赖于因子的终止子（强） （2）依赖因子的终止子（弱终止子）,2019/5/7,106,不依赖于因子的终止子有2个特征（强终止子） 在DNA中，在转录单位的终点之前都有一个回文结构，其转录本形成发卡结构，且柄部富含GC碱基对。 终点前大约有6 个连续的A，它转录成U。,2019/5/7,107,寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。,依赖的终止子，必需在因子存在时，才发生终止作用。终止点前无寡聚U序列，回文对称区不富含GC。,2019/5/7,108,有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶得以越过终止子继续转录，称为通读（ readthrough）,能够引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子（antitermination factors）,因子是一个碱性的蛋白,三个二聚体组成.与合成的RNA结合,移动到终止信号,再与RNA聚合酶结合,使之离开摸板.,2019/5/7,109,RNA合成过程,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子（promoter),终止子(terminator),2019/5/7,110,基本原则与原核相似，但真核基因的转录更复杂， RNA聚合酶不相同 启动子有三类，分别由RNA聚合酶I、II、III进行转录。 真核生物的启动子由转录因子，而不是RNA聚合酶识别（没有对应的因子） 转录因子：RNA聚合酶在进行转录时，常需要一些辅助因子（蛋白质）参与作用，此类蛋白质统称为转录因子。 多种转录因子和RNA聚合酶在起点形成前起始复合物，起始转录。,1.3 真核生物的转录,2019/5/7,111,分子量都在50万左右,真核生物RNA聚合酶,2019/5/7,112,1.4 RNA生物合成的抑制剂,1.4.1 嘌呤和嘧啶类似物：人工合成的碱基类似物能够抑制和干扰核酸的合成。如,SH,SH,作为代谢拮抗物抑制 合成酶类或直接掺到核酸 分子中，形成异常RNA 或DNA。,2019/5/7,113,1.4.2 DNA模板功能的抑制物：可以与DNA模板结合，抑制其复制和转录,（1）烷化剂：使DNA发生烷基化，发生在G-N7，A-N1、N3 N7 ；C-N1。易引起嘌呤的水解，在DNA上留下空隙干扰复制或转录；或引起碱基错配。 （2）放线菌素：放线菌素D与DNA形成非共价的复合物，抑制其模板功能（低浓度抑制转录，较高浓度抑制复制）。具有类似作用的还有色霉素A3 、橄榄霉素、光神霉素。 （3）嵌入染料：可插入双链DNA分子相邻的碱基对之间，一般具有芳香族发色团。吖啶类染料；溴化乙锭（EB）。EB是一种高灵敏的荧光试剂，常用来检测DNA和RNA。与DNA结合后抑制其复制和转录。,2019/5/7,114,嘌呤和嘧啶类似物： 可通过抑制核苷酸的合成，抑制 RNA生物合成。 还能掺入核酸分子中去，形成异常DNA、RNA，影响核酸功能。 人工合成的主要有：6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、2.6二氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶 、6-氮尿嘧啶 碱基类似物进入体内后需转变成相应的核苷酸，才表现出抑制作用。 烷化剂： 氮芥（二（氯乙基）胺的衍生物）、磺酸酯、氮丙啶、乙撑亚胺类。它们带有活性烷基，使DNA烷基化。 烷化位点：鸟嘌呤N7 ，腺嘌呤N1、N3、N7，胞嘧啶N1 烷基化后，碱基易被水解下来，留下的空隙可干扰DNA复制或引起错误碱基掺入。带有双功能基团的烷化剂，可同时与DNA两条链结合，使双链DNA交联，从而失去模板功能。 放线菌素D： 有抗菌和抗癌作用。 它可与DNA形成非共价复合物，使其多肽部分在DNA的“浅沟”上如同阻遏蛋白一样，抑制DNA的转录。,2019/5/7,115,此类机理的放线菌素还有色霉素A3、橄榄霉素、光神霉素。 嵌入染料： 扁平芳香族染料，可插入双链DNA相邻碱基对之间，使DNA在复制时缺失或增添一个核苷酸，从而导致移码突变，并能抑制RNA链的起始及质粒的复制。 溴化乙锭、吖啶类染料（原黄素、吖啶黄、吖啶橙等）。 RNA聚合酶的抑制物 （1） 利福霉素 包括其衍生物利福平，特异地抑制细菌RNA聚合酶的活性。 强烈抑制革兰氏阳性菌和结核杆菌，它主要抑制RNA合成的起始。 （2） 利链菌素 与细菌RNA聚合酶亚基结合，抑制转录过程中链的延长。 （3） -鹅膏蕈碱 主要抑制真核RNA聚合酶和，对细菌的RNA聚合酶作用极小。,2019/5/7,116,1.4.3 RNA聚合酶抑制物,（1）利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶活性。利福平可以高效抑制结核杆菌，杀死麻疯杆菌，在体外有抗病毒作用。 （2）利链霉素：与细菌RNA聚合酶亚基结合，抑制转录过程中RNA链的延长反应。 （3）-鹅膏蕈碱：抑制真核生物RNA聚合酶活性。,2019/5/7,117,2 RNA的转录后加工(post-transcriptional processing) 在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物（primary transcript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5和3末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。,2019/5/7,118,2.1 mRNA前体的加工（真核）： 原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。亦有少数多顺反子的mRNA需要核酸酶切成小单位，然后再翻译。 真核生物mRNA（半寿期较长）原初转录物很大，在加工过程中形成许多分子大小不等的中间物，它们被称为核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)，其中大约25%需要进一步进行加工修饰转化为mRNA。加工包括： （1）3端添加polyA “尾巴”； （2）5端连接“帽子”结构（m7G5ppp5NmpNp-）； （3）hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录序列拼接上(真核生物一般为不连续基因)。 （4）分子内部的核苷酸甲基化修饰。,2019/5/7,119,2019/5/7,120,2.2 tRNA前体的加工： 原核与真核生物的tRNA转录后都需要加工。包括： （1）由核酸内切酶切除前体上3和5端上多余的核苷酸； （2）由核酸外切酶逐个在3切去附加序列，进行修剪。 （3）3 端添加CCAOH序列，由核苷酰转移酶催化。 （接受活化AA） （4）核苷的一些特定的碱基和戊糖进行修饰。,2019/5/7,121,2019/5/7,122,原核与真核生物的rRNA转录后也都需要进行加工。 原核：刚转录的rRNA为30S，先在特定的碱基上进行甲基化（核糖2-羟基）修饰，后逐步裂解（核酸酶的切割）。 真核：45S（哺乳动物）、38S（果蝇）、37S（酵母）,P16,P23,P5,16S,23S,5S（一般不含甲基化）,28S,18S,5.8S,2.3 rRNA前体的加工：,45S 或38S,37S,26S 17S 5.8S,真核rRNA的甲基化程度比原核高（核糖2-羟基）,rRNA原初 转录物30S,研究四膜虫rRNA前体的拼接时发现ribozyme,2019/5/7,123,2019/5/7,124,1.模板：DNA 2.原料：核苷酸 3.合成方向：5 3 4.酶：依赖DNA的 RNA聚合酶 5.碱基互补配对规律 6.产物：多聚核苷酸链,相同点：,2.4 转录和复制的区别,2019/5/7,125,不同点：,模板 两股链均作为模板 模板链作为模板 原料 dNTP NTP 聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 产物 子代DNA双链 mRNA;tRNA;rRNA 配对 A-T；G-C A-U；T-A;G-C 引物 RNA引物 不需要引物 方式(特点) 半保留复制 不对称转录,2019/5/7,126,两个阶段 （1）其单链RNA可充当mRNA，利用寄主中的核糖体合成外壳蛋白和复制酶的亚基。 （2）复制酶的亚基可与来自寄主细胞的亚基自动装配成RNA复制酶，可进行RNA的复制，以分子中单链RNA为模板（正链），复制出一条新的RNA链（负链），再复制出正链，与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。,3 RNA的复制（噬菌体Q和灰质炎病毒）,某些RNA病毒可以以自身RNA为模板进行复制。,不同的RNA病毒复制方式不同 P333。,2019/5/7,127,病毒RNA复制的主要方式,单链（+）RNA病毒的复制方式（噬菌体Q和灰质炎病毒）(只含病毒正链RNA) 单链（-）RNA病毒的复制方式（狂犬病毒）(病毒负链RNA+复制酶)； 双链RNA病毒的复制方式（呼肠狐病毒）(双链RNA+复制酶)； 致癌RNA病毒,2019/5/7,128,不同RNA病毒合成mRNA的 途径可以分4类,逆转录病毒,噬菌体Q,狂犬病毒（带有复制酶）,呼肠孤病毒 （带有复制酶）,逆转录酶,2019/5/7,129,1、正链RNA病毒（mRNA）：噬菌体Q、灰质炎病毒等。 进入寄主细胞后，利用寄主的翻译系统，首先合成复制酶及有关的蛋白质，然后进行病毒RNA的复制，最后由病毒RNA（+）和蛋白质装配成病毒颗粒。 2、负链RNA病毒（带有复制酶）：狂犬病毒等 此类病毒带有复制酶，侵入后，复制酶首先合成出正链RNA（mRNA），再以正链RNA为模板，合成负链RNA及蛋白质，然后装配。 3、双链RNA病毒（带有复制酶）：呼肠孤病毒等 以双链RNA为模板，在复制酶作用下先转录正链RNA（mRNA），从而翻译出蛋白质