[农学]第11章 细胞破碎.ppt

,第11章 细胞破碎技术,不同类型的细胞分泌目标产物的类型：,动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌 在培养液中。 植物细胞：多为胞内产物。 微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外；大多数大分子产物和基因重组产物为胞内产物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等均为胞内产物。 对于胞内产物，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。,本章内容,1、细胞壁的组成和结构 2、细胞破碎相关知识 3、机械破碎法； 4、化学破碎法 5、物理破碎法,为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种生物细胞壁的组成和结构。,1、细胞壁的组成和结构,革兰氏菌细胞壁结构图 （a）革兰氏阳性菌 （b）革兰氏阴性菌,酵母细胞壁的结构示意图 M甘露聚糖； P磷酸二酯键； G葡聚糖,细菌 破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固； 酵母 葡聚糖的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架，甘露聚糖形成网状结构，细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度； 霉菌 细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高； 植物细胞 次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。,不同类型的细胞壁,细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。,定义,细胞破碎的意义,细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型成分的基础。有效的细胞破碎对分离和纯化任何细胞内活性药物成分都是必要的。,2、细胞破碎,2.1 破碎程度的评价,破碎程度常用细胞破碎率（%）表示。 破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即： Y（%）=（N0-N）/N0*100 其中N0原始细胞数量； N 经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。,N0和N的确定方法： 直接计数法：通过平板计数技术或血球细胞器上用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。 间接计数法：在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（eg.可溶性蛋白、酶等）。,研 磨,2.2 细胞破碎技术,破碎方式,机械法,非机械法,固体剪切 作用,液体剪切 作用,干燥 处理,溶胞 作用,磨珠法,高压匀浆,超声破碎,酶溶法,化学法,物理法,细胞破碎机理图,常用破碎方法,影响破碎难易程度的重要因素：,机械法细胞的大小和形状、细胞壁厚度、聚合物交联程度。显然，细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。（破碎细胞） 非机械法细胞壁、膜的组成和结构。了解细胞壁的组成和结构，就可选择合适的溶菌酶和化学试剂，以及在使用多种酶或化学试剂相结合时确定其使用的顺序 。（溶解壁膜上的某些组成打洞）,3、机 械 法,3.1 高压匀浆法（High-pressure homogenization）,利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,原理：,大规模细胞破碎的常用方法，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用.,采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。,高压匀浆器的排出阀结构,19.6-25.4MPa,适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎,实验室级高压均质仪,大、中、小型高压匀浆器,高压匀浆法使用时注意事项,高压匀浆器的操作温度上升约-3/10MPa，为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20左右。 可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。,高压匀浆法适用的范围,大规模细胞破碎的常用方法 高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎； 料液细胞浓度可以很高，20%左右。 不宜使用高压匀浆法。 易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,影响高压匀浆器细胞破碎因素,被破碎的细胞分率符合如下公式： ln1/(1-R)=KNP 式中 R 破碎率，为N次循环后，蛋白质的释放量Rn与最大释放量Rm之比； K 与温度有关的速度常数； P 操作压力，MPa； 与微生物种类有关的常数。,升高压力有利于破碎 减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。 但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p超生一定值时，R增加但很慢。 在工业生产中，通常采用的压力为5570Mpa。,影响高压匀浆器细胞破碎因素（续）,影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆 器的次数。,温度的影响： 有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在450-750kg/m3时，温度由300C提高到500C，破碎率约提高1.5倍。 破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同 大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎,细胞浓度及压力大小对破碎率的影响,3.2 高压匀浆法-X-挤压器（X-press法）,改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至-25至-30形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。 细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。 主要用于实验室中。 优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，对冷冻一融解敏感的生化物质不适用。,3.3 珠磨法 bead mill,珠磨是常用的方法 细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。 在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机,WSK卧式高效全能珠磨机,高速珠磨机工作原理,磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动； 细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起 在出口处，旋转园盘和出口平 板之间的狭缝很小，可阻挡玻 离小珠，使不被料液带出。 由于操作过程中会产生热量， 故磨室还装有冷却夹套，以冷 却细胞悬浮液和玻离小珠。,A-具有冷却夹套的圆筒形磨室 B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘 C-环形震动侠缝分离器 D-变速马达 1和2料液进出口 3和4 搅拌冷却剂进出口 5和6磨室冷却剂进出口,玻璃珠,氧化锆,几种常见珠磨器,珠磨式组织研磨器,利用微细玻璃珠，在高速运转下的相互碰撞，造成组织细胞的破裂与分散。适合珍贵样品液的研磨，例如蛋白质、酶及细胞液等。微细玻璃珠可回收使用。样品处理量，含玻璃珠可达350ml。 样品量可达80g,小型珠磨器,密闭容器可容纳1至1.5ml的组织液或是一些细胞悬浊液，通过1至3分钟的剧烈搅拌，能使细胞彻底的破裂，甚至一些骨头、微生物的孢子通过玻璃珠的研磨也能有效的磨碎。 玻璃珠适用性： 细菌用0.1mm的玻璃珠 酵母、藻类和组织培养细胞用 0.5mm的玻璃珠 动植物的组织用1mm的玻璃珠,WSK卧式高效全能珠磨机,ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机,珠磨机破碎作用方程,破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式： ln1/(1-R)=Kt R 破碎率； K一 一级反应速度常数； t一 时间。 K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。,珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。,影响破碎效果的因素,影响因素：珠体的直径、进入珠磨机的细胞浓度、料液的流速、搅拌器的转速和构型、温度等。 珠体的大小：应根据细胞大小和浓度以及在连续流动的操作过程中不使珠体带出来选择。,珠体的装量：影响破碎程度和所需能量。 搅拌速度：增加搅拌速度能提高破碎效率，但过高的速度反而会使破碎率降低，能量消耗增大，所以搅拌转速应适当。,高压匀浆法与高速珠磨法的比较,3.4 超声破碎,机理：超神波破碎机的频率是1520kHz，细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，由于这种空穴泡又受到超声婆的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由此引起的黏滞性漩涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，造成细胞破碎。,超声破碎,破碎效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。 优点：操作简便，液量损失少 存在问题：使敏感物质变性失活，噪声大，大容量时效率低，应用潜力有限。 操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。,超声波破碎的适用范围,超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。,超声波破碎仪,大功率 超声波破碎仪,空穴现象,锡箔纸测试空化强度与空化密度,看得到的空穴现象,在强声波作用下，引起气泡形成，胀大和破碎的现象。,实验室连续破碎池结构示意图,4 非 机 械 法,非机械破碎方法,酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment） 去垢剂破碎法（detergents） 渗透压冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing）,4.1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis),酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。 （1）外加酶法,溶菌酶主要用于细菌类,外加酶法,酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。 溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶， 酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。,55,外加酶法,有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。 对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,酶解法的特点,优点： 发生酶解的条件温和 能选择性地释放产物 胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整,缺点： 溶酶价格高， 溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶) 产物抑制的存在。,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。 缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,（2）自溶法（Autolysis）,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,4.2 化学渗透法（Chemical permeation）,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。 碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。 成本低，反应激烈，不具选择性。,（1）酸、碱处理法,细胞破碎常用的表面活性剂： 十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）； 非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等 对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。,（2）表面活性剂,无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用， 能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解,能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等,（3）有机溶剂,（4）EDTA螯合剂,处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。 G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。,通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒。 化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难， 并影响最终产物纯度,化学渗透法特点：,缺点,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,优点,5 物理法,渗透压冲击法 冻结-融化法 干燥法,1）渗透压冲击法,渗透压冲击是较温和的一种破碎方法， 将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗