《常用药效筛选试验》PPT课件.ppt

常见药效筛选试验,解表药主要药理作用： 1.发汗 2.解热 3.镇痛 4.抗病原微生物 5.抗炎 6.影响免疫功能 常用药：麻黄、桂枝、柴胡、葛根、荆芥、菊花、防风等。,清热药主要药理作用： 1. 抗病原微生物 2. 解热 3.抗炎 4.影响免疫功能 5.抗自由基 6.抗肿瘤 常用药：黄芩、黄连、知母、赤芍、银花、连翘、板蓝根、穿心莲、决明子、地骨皮等。,考察解表药发汗作用,汗法是中医治疗表证的重要方法之一，可以利用：汗液着色法、汗腺上皮组织形态观察法和汗液定量测定法并结合皮肤电生理技术研究解表药对汗腺分泌、汗腺活动及汗液分泌量的影响。 发汗机制： 扩张汗腺导管，增加汗液分泌； 兴奋汗腺受体、M受体，促进汗液分泌； 中枢神经的调节及改善血液循环促进发汗。,考察解热作用,方法：常采用菌苗或内毒素等引起的感染性发热以及用松节油和二硝基苯酚等引起的非感染性发热观察受试药物的退热作用。通过对实验性发热大鼠体温调节中枢温度敏感神经元放电频率及发热动物脑脊液中PGE、cAMP含量的影响，分析解表药作用机制和部位。,观察清热药的解热作用,发热是里热证的重要表现，研究清热药应首选以内毒素所致的发热反应，其次如酵母性发热、角叉菜胶所致发热及二硝基酚性发热也可选用，还可选用内生致热原生成及致热试验、微量PGE脑室内或下丘脑注射致热试验等用于研究清热药的解热作用。,解热实验（解表药、清热药）,家兔：IV伤寒、副伤寒联合菌苗、内毒素致热 大鼠：鲜酵母液皮下注射致热 方法：随机分组后，先测量各动物给药前正常体温，给药后30分钟造模，于致热物质注射后的5、30、60、90、120、240min时间点测量动物的体温，计算体温升高的百分率。,（三）观察抗炎、抗过敏作用,炎症是表证证候的主要病理过程。抗炎是解表治疗的主要对症措施。解表药物对炎症的早、中、晚期均有作用，但考虑表证的特点，解表药的抗炎作用评价应以渗出、肿胀、白细胞游走或毛细血管通透性增强等急性炎症过程为主要观察指标，观察受试药物的抗炎作用。,观察清热药的抗炎作用,清热药主要用于急性传染、感染性炎性疾病，其抗炎作用的主要特点是以抑制早期炎症为强，对中、晚期炎症作用相对较弱或无，这与其在临床能较快解除以红、热、肿、痛为特点的“热证”相吻合，以感染初期的炎性渗出、毛细血管通透性亢进为主要观察指标，研究清热药的抗炎作用。,抗过敏试验,变态反应临床分为、型。其中型变态反应的发病机制较为清楚，多数试验方法反映型变态反应的发病机制，包括被动皮肤过敏反应试验（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）、过敏性支气管痉挛试验、Schultz-Dale反应试验、抗过敏介质试验及肥大细胞试验等。,小鼠耳廓肿胀法：致炎物质有巴豆油、二甲苯 大鼠足跖肿胀法：致炎物有蛋清、角叉菜胶、甲醛等。 血管通透性实验：静脉注射伊文氏兰，观察染料在皮下组织的渗出量。 肉芽组织增生实验：手术皮下置入固定量棉球，一段时间后，取出棉球称重。比较给药与不给药组动物身上取出棉球重量的差异。,常用抗炎实验方法,足趾容积测量仪,抗炎实验祛风湿药,佐剂型关节炎：免疫性关节炎病理模型。 佐剂的制备：取冻干卡介苗50mg，80C，1小时灭活，混入灭菌石蜡油、羊毛脂（1：1）12.5ml，制成完全佐剂。 造模方法：无菌条件下足趾皮下注射0.1ml，19天后开始给药。 观察指标：体重、足趾厚度、致炎后12天开始观察继发性全身关节病变程度，计算关节炎指数。电镜观察关节滑膜组织细胞有无肿胀、变性、坏死。,抗炎实验观察指标-致炎因子,高迁移率族蛋白B1（HMGB1）：是一种DNA结合蛋白，作为细胞因子参与炎症反应。该后期致炎因子可导致败血症，是抗炎治疗的一种新的靶分子。 肿瘤坏死因子（TNF）：是重要的早期一过性释放的致炎因子。 白介素1（IL-1 ）、白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）、白介素8（IL-8） 前列腺素（PGE2）、白三烯 MIP - 1、MIP- 1：巨噬细胞炎症蛋白,HMGB1,炎症发生 1218小时后血清 HMGB1活性最高并维持 水平，而 TNF、IL-1等因子只是在炎症发生后几小时内达到峰值后又回到基础水平。因此 ，特异地抑制 HMGB1的释放和活性是一种非常有希望 的抗炎策 略 ，尤其是治疗炎症晚期所引起的败血症。研 究还发现，由受损组织和活化的免疫细胞释放的 HMGB1可作为自身免疫原引起自身免疫性疾病 ，如 RA（类风湿性关节炎）、SLE（系统性红斑狼疮）等。 HMGB1也是治疗自身免疫性疾病重要 的 靶分子。,炎性疾病 (AS、多脏器纤维化),毒损肺络 (与呼吸道疾病相关),血栓性疾病 (组织缺血所致炎症级连反应),毒损脑络 (脑病相关),“清热解毒”功效抑制炎症反应,注意： 不同疾病检测部位和指标有所区别 非选择性抗炎作用（角叉菜胶足肿胀、二甲苯耳肿胀）不是主要。,退 热 抗 炎 抗肺纤维化 抗多脏衰竭作用,抑制病原体,改善症状,治疗呼吸道病毒感染的研究内容,急性呼吸窘迫综合症,多器官功能障碍综合征,观察指标,流感病毒肺炎模型 肺指数、死亡率,血清、肺组织与炎症有关 细胞因子 急性期： NO、EOS、IL-1、IL-4、IFN-Y 、TNF-A等 感染中后期： TNF-A（感染后12小时达峰） 碱性迁移蛋白（感染后72小时达峰）,神经元特异性烯醇化酶,（四）观察镇痛、镇静作用,肌肉酸痛、烦躁是表证主要症状之一，镇痛、镇静试验是考核解表药对症治疗作用的常用方法。 致痛方法有物理性（热、电、机械）和化学性（醋酸、钾离子、缓激肽、催产素等）两类，常用动物为小鼠、大鼠、豚鼠、家兔或犬等。 常用评价指标为嘶叫、舔足、甩尾、挣扎或皮肤及肌肉抽动等。 镇静试验：观察受试药物对动物一般行为（非条件行为）的影响，判断是否有中枢抑制（或兴奋）作用，记录方法有直接观察（行为分级）和仪器记录两类。,镇痛实验,方法：机械刺激、电刺激、热刺激、化学刺激致痛法（造模物质）,检测指标：痛阈值、痛阈提高百分率。,冰醋酸、 酒石酸锑钾,常用动物：小白鼠、大白鼠,智能热板仪,电子压痛仪,实验仪器,考察镇静、催眠作用,自发活动观察：吊笼法、旷野法、活动仪,睡眠实验：观察指标有潜伏期、睡眠时间（翻正反射消失时间）、睡眠发生率,观察抗菌、抗病毒作用,里热证的病因多为病原微生物感染，因而需进行清热药的抗菌、抗病毒研究， 中药对急性感染具有“广谱”的特点，宜选用较广泛的菌株进行体外抗菌试验，选用敏感菌株进行感染动物的保护试验。并注意对细菌感染过程各阶段的影响，如对细菌于粘膜表面的粘附能力的影响；对细菌耐药性的影响等。 抗病毒体外实验：通常采用病毒鸡胚接种法或组织细胞培养法，测定病毒生长情况及观察细胞病变情况，评价药物对病毒增殖的抑制作用。体内实验是将病毒接种于易感动物体内造成病毒感染，给予中药（在感染前或/和感染后给药）进行干预，以动物存活率、存活时间或以动物器官病变程度等指标来判断药物抗病毒作用。由于清热药的多成分干扰，抗菌、抗病毒作用应以体内研究为主。,抗菌实验（清热药）,体外：管碟法、平皿法（抑菌圈直径、最低抑菌浓度和最低杀菌浓度） 体内：整体动物感染细菌（最低致死浓度感染），观察死亡率。,抗细菌毒素,观察清热药的抗内毒素作用,内毒素（endotoxin）是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，在细菌死亡自溶或粘附在其他细胞时，才表现其毒性。内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。 清热药抗内毒素作用研究主要有四个方面：增强机体对内毒素的解毒能力；改善机体对内毒素的反应性；消除肠源性内毒素池及直接使内毒素解毒。 实验方法：采用给动物静脉注射大肠杆菌或伤寒杆菌的内毒素形成内毒素血症，或夹闭大鼠的肠上动脉造成肠源性的内毒素池观察药物对模型动物的体温变化、白细胞数量、血液流变学、微循环及死亡率等指标的影响。,观察清热药对血液系统及微循环的影响,发热失水可致血液浓缩，病原体及其毒素可以激活血小板、内外凝血系统继而出现血凝活性异常，呈现“热瘀互结”、“气血两燔”、“耗血动血”。微循环障碍不仅造成局部的“缺血缺氧”环境而损伤机体抗感染防御能力，也给药物的多种疗效带来困难。 针对清热凉血药可从抑制血小板聚集、抗血栓形成、改善血液流变性等方面开展研究。,理气药、芳香化湿药、泻下药、消食药 -主要作用于消化系统,泻下药主要药理作用：泻下、利尿、抗病原微生物、抗炎、抗肿瘤。 芳香化湿药主要药理作用：对消化道的调节作用、抗病原微生物作用。 理气药的主要药理作用：对消化道的双向调节作用、利胆、松弛支气管平滑肌、心血管系统影响、对子宫的作用等。,观察泻下作用及致泻机理的研究,常采用肠管动力实验法观察此类药物的泻下作用，研究泻下作用部位、作用方式。 可采用失水便秘模型、地芬诺酯模型、次炭酸鉍大鼠便秘模型、实热型便秘模型等重点观察药物的通便作用及肠道水分吸收的影响。,不吸收,肠内容物推进速度试验法 碳末推进实验（泻下药） 碳末排出时间试验（泻下或止泻） 酚红定量测定法（测定胃肠道不同部位的酚红含量，分析胃排空速度和不同肠段的推进运动功能。（对胃肠运动的影响） 胃动素、胃泌素的测定（理气药）,对胃肠运动的影响,检测小鼠胃内容物中甲基橙光密度来考察药物对小鼠胃排空机能的影响； 采用胃肠内标记物葡聚糖蓝-2000在胃内色素相对残留率及小肠推进比，观察药物对胃排空及肠推进的影响； 采用胃肠动力障碍模型，观察药物对肠蠕动减缓的拮抗效应。 体外观察药物对动物离体胃、肠平滑肌活动的影响，并可观察药物对乙酰胆碱、阿托品（M阻断）、六烃季胺（N阻断）、心得安（阻断）、酚妥拉明（阻断）等胃肠作用的影响，初步了解其作用机制。,芬氟拉明致胃动力障碍模型，盐酸多巴胺致胃排空延迟模型，L-Arg（左旋精氨酸）致胃动力障碍模型,胃排空实验 取24小时禁食不禁水小鼠50只，随机分组后给药，40min后将各鼠灌0.1%甲基橙0.2ml，再过20min后将小鼠脱颈椎处死。取胃置于装有5ml蒸馏水的小烧杯中，剪开胃大弯，冲冼胃内容物，用NaHCO3调PH值至66.5，倒入刻度离心管，以2000rmin-1离心10min，取上清液用UV-9100紫外可见分光光度计于420nm处比色，另准备10ml蒸馏水加入0.1%的甲基橙0.2ml为标准对照。测量各组吸光度,并计算残留百分率。 胃中甲基橙残留率(%)=胃中冲洗上清液吸光度/甲基橙对照管吸光度*100%。,肠推进率实验 取24小时禁食不禁水小白鼠，随机分组，每组10只，灌胃给药，30分钟后断颈椎处死动物，打开腹腔，取出全部肠组织。测量。 肠推进率%=幽门到碳末前沿的距离/小肠全长*100%,胃动素（MTL）、胃泌素（GAS）测定（理气药） 大鼠，随机分组后，灌胃给药每天1次，连续四周。每天记录进食量，每周称体重调节给药量。于末次给药后24小时麻醉大鼠，颈动脉取血，2ml血抗凝处理测血浆MTL；3ml血不做抗凝处理，用于测定血清GAS。,胃泌素几乎对整个胃肠道均有作用，它可促进胃肠道的分泌功能；促进胃窦，胃体收缩，增加胃肠道的运动，同时促进幽门括约肌收缩，故其整体综合作用是延缓胃排空而不是促进胃排空；促进胃及上部肠道粘膜细胞的分裂增殖；促进胰岛素和降钙素的释放。,胃动素是一种多肽，在空肠粘膜的浓度最高，有强烈刺激上消化道的机械运动和生理性肌电活动的作用。,抗腹泻作用（理气药）,甲硫酸新斯的明造成小鼠小肠痉挛模型，观察药物对小肠痉挛的拮抗作用。 番泻叶与蓖麻油引起腹泻的小鼠模型，观察药物对腹泻潜伏期、腹泻率、腹泻级数及腹泻指数的影响。,湿粪计数法 药物对正常小鼠排便的影响；对新斯的明和蓖麻油致腹泻的对抗作用(止泻）。（观察服药后一定时间内排出的湿粪粒数）。,在体肠实验 1、肠管悬掉法 2、肠内应变片法（放应变片）或内压法（球囊）。应变片法：将半导体应变片缝置在胃肠浆膜上，通过压力传感箱，将收缩活动记录下来。,一个电阻元件，将应变片用粘合剂粘贴在被测试件的表面上，随着试件受力变形，应变片的敏感栅也获得同样的变形，其电阻随之发生变化，电阻变化转换为电压或电流变化，记录下来，可反映被测试件应变量的大小。,离体肠实验 定性：看曲线 定量：拉丁方设计给药（排除离体时间不同和药物影响带来的差异），足够样本数；根据实验曲线定量测量振幅和频率的变化，以率表现较合理。（差值是个绝对数，率是相对数）,助消化、助吸收的作用（理气药、消食药）,对胃分泌功能的影响：胃酸含量及胃蛋白酶活性 小肠葡萄糖吸收功能：右旋木糖吸收试验，3H-葡萄糖吸收试验 胰液分泌功能：检测胰液分泌量及胰蛋白含量 对脾虚模型动物影响：一般症状和体征的影响，并重点从胃液分泌、胃肠运动、胃肠激素及胃肠黏膜的病理形态改变等评价其作用及机制。,观察泻下药抗感染、抗肠粘连作用,泻下药不仅可增强肠蠕动，还可从抗病原微生物、抗炎解热、改善血液循环，促进肠腔渗出液吸收，改善肠粘连和肠缺血入手考察本类药物对急腹症的治疗作用。 建立套叠性肠梗阻模型观察药物促进肠套叠还纳，解除肠梗阻的作用；利用缺血性肠梗阻模型考察药物对缺血性梗阻肠管血循环作用；通过观察药物对细菌性肠粘连模型的影响，研究药物对肠粘连及炎性渗出等作用。,芳香化湿药,还可以进行相关抗炎、镇痛作用研究。 探讨其作用机制，可以测定血清和组织中胃动素和胃泌素，以及P物质、血管活性肠肽的含量变化，考察对内分泌激素和脑肠肽的影响； 测定胃肠道组织超氧化歧化酶活性、丙二醛含量，考察抗氧化活性。,湿邪影响到多器官功能的发挥，很多现代疾病与芳香化湿药所主治的病证有不同程度相关性。包括胃肠型感冒、功能性消化不良、消化性溃疡、肝炎等消化系统疾病，慢性感染性疾病，老年性痴呆、癫痫等神经精神系统疾病，动脉粥样硬化、心肌缺血、心律失常等心血管系统疾病，肿瘤，以及各种原因引起的组织器官氧化损伤、炎症反应等。,考察抗溃疡作用,对不同因素致溃疡模型动物的影响 造模：水浸应激性胃溃疡、乙酸烧灼性胃溃疡、幽门结扎型胃溃疡、乙醇损伤胃黏膜模型、利血平溃疡模型。 观察指标：测量胃液量、胃液酸度、游离盐酸和总酸度测定，胃蛋白酶活性测定。黏膜中及血中PGE2含量等，组织学观察溃疡面积、溃疡点数，计算溃疡指数（面积）、溃疡抑制率。,考察药物利胆作用理气药、泻下药,观察胆汁分泌量并通过分析胆汁中胆固醇、胆红素、胆汁酸以及无机离子等含量，研究药物对胆汁分泌、排泄和代谢的影响； 通过胆囊运动及胆道括约肌紧张度实验，研究药物对胆囊压力、胆囊排空的影响； 建立胆道感染、胆结石及胰腺炎病理实验模型，观察药物的治疗作用。,抗肝损伤实验,肝细胞损伤的体外模型：分离培养肝细胞，造损伤模型（四氯化碳、醋氨酚、过氧化氢、氰化钾、硫代乙酰胺、内毒素、半乳糖胺） 肝细胞分泌功能测定：胶原生成率、白蛋白分泌量、ALTAST测定、CAMPCGMP测定、肝细胞DNA合成速率测定、肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶活性测定。 肝星状细胞体外模型及功能测定：对肝星状细胞增殖的测定、胶原生成率测定。,星状细胞合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分， HSC是正常及纤维化肝脏中细胞外基质的主要合成细胞，可以分泌肝细胞生长因子（HGF），参与肝细胞再生的调控；储存脂肪 。,实验性肝损伤体内实验：化学性肝损伤（四氯化碳、氨基半乳糖、扑热息痛）、免疫性肝损伤（卡介苗和脂多糖诱导肝损伤、刀豆蛋白A诱导肝损伤）、酒精性肝损伤（可采用复合因素，酒精灌胃法、酒精饮料模型、酒精液体食料模型、酒精加内毒素模型、酒精加铁过载模型）,改善神经精神活动作用理气药,功能性消化不良是抑郁证的共病之一，通过调节胃肠功能可改善抑郁症患者的神经精神症状。抑郁症的动物模型主要可分为两类：一类属于药物诱发的模型，包括育亨宾模型，5-HTP诱发甩头行为，利血平致单胺类递质耗竭模型等；另一类为改变环境条件诱发的抑郁模型，如束缚、隔离、疲劳应激、行为绝望、慢性不可预知应激、慢性温和应激等。此外，还有脑损伤致抑郁症模型（如嗅球切除模型）以及90年代以来出现的基因选择的大鼠行为抑郁模型如游泳低活性模型、FSL（Flinders sensitive line，遗传行为抑郁大鼠）大鼠模型等。,温里药药理作用,对消化系统作用：增加胃肠动力，促进消化、抗溃疡 对心血管系统作用：强心、抗心肌缺血、抗休克 对内分泌系统作用：促进激素的合成、分泌，抗炎、增加产热、抗寒冷。,抗休克实验,休克模型： 失血性休克模型 内毒素诱导感染性休克模型 烧伤引起休克模型 家兔肠系膜上动脉闭塞性休克模型,心源性休克可用物理或化学方法损伤心肌，冠状动脉阻塞法（结扎、栓塞等），诱发心源性休克，观察其药理作用。 可采用血压测定仪或生理记录仪测定动物正常血压及低血压状态的血压，观察药物对低血压状态的影响以判断该药是否具有抗休克作用。 可对休克模型血流动力学、微循环、细胞超微结构以及代谢、体液因子和毒素等方面的改变进行研究。,考察强心作用,采用心衰模型观察药物对心肌收缩率、心率和心输出量的影响； 结合不同模型进行心肌病理、超微结构观察，检测血中神经内分泌相关指标研究药物治疗心衰的作用机制 体外培养心肌细胞实验法可以对心肌兴奋性、不应性、自动节律等指标定量观察，还可以观察中药对心肌细胞搏动频率和收缩力的影响，进而分析作用原理。 离体心脏实验,抗心肌缺血缺氧作用,采用心肌缺血模型、心肌缺血再灌注损伤模型、心肌缺血缺氧模型，通过心脏功能，血流动力学，血液流变学试验，心肌耗氧量试验，扩张外周血管及微循环试验，定量分析药物对心肌损伤程度、心脏功能的影响。 考察对血小板活性和微循环的影响、抗氧自由基作用、调节细胞释放NO的影响、心肌酶的影响、心肌细胞凋亡的影响，探讨药物抗心肌缺血的作用机制。,血液系统实验（止血药、活血化瘀药）,止血：出血时间、血浆复钙时间、凝血时间、凝血因子的影响。 补血：RBCWBCPLTHB,骨髓造血系统（骨髓造血干/祖细胞的增殖和分化，抑制凋亡 ） 活血：血液流变学（浓、粘、凝、聚指标）、动力学（血管照影）、微循环指标改善（微血管、微血流、毛细血管通透性）,血液黏度、血液的触变性，黏弹性、红细胞压积等；红细胞类指标如红细胞聚集性，红细胞变形性、红细胞膜的微黏度、红细胞电泳等，血小板类指标：如血小板聚集性、血小板黏附性、血栓弹力度、体外血栓的形成与测定等；血浆类指标：如血浆黏度、血浆纤维蛋白原等,对凝血系统和纤溶系统功能的影响,股动脉切口试验及小鼠剪尾试验检测药物对出血时间及出血量的影响；监测凝血时间、活化部分凝血活酶时间分析药物对内源性凝血途径的影响；监测凝血酶原时间（PT），分析药物对外源性凝血系统的影响；监测凝血酶时间（thrombin time，TT）研究药物对凝血、抗凝及纤维蛋白溶解系统功能影响； 监测血浆纤维蛋白原、纤维蛋白肽A（FPA）、凝血酶原片段F1+2、组织因子、可溶性纤维蛋白单体复合物、因子IX-35、IX-9、因子X-52、X-15肽片段研究药物对凝血系统的影响。,对血小板功能的影响,检测血小板黏附功能：玻璃珠法、玻璃纤维法、灌注小室法； 检测血小板聚集功能：比浊法、比值法； 检测血小板释放功能：-血小板球蛋白（-TG）、血小板活化因子4（PF4）、5-HT、血浆颗粒膜糖蛋白-140（GMP-140）等 血小板与红细胞、白细胞及内皮细胞之间的相互作用也是血小板参与凝血过程的机制之一，因此，检测他们之间的相互作用有重要意义。,对血流动力学影响-止血、活血,体外实验：采用离体器官血管灌流法（兔耳、下肢、肝、肾、肠系膜血管）、离体主动脉条实验法等研究药物对血管的舒缩作用。 对心肌缺血和脑缺血模型动物的改善。 体内可通过在体局部血管阻力测定法和通过检测血管活性物质观察药物作用。检测平均动脉血压、总外周阻力、每搏输出量、组织器官血流量、心脏指数、动脉顺应性。 血管造影（图像分析）考察整体动物动力学改变。,抗血栓形成,针对血管内皮损伤：血管内皮细胞进行体外培养，分别测定内皮细胞释放的活性物质，如前列腺素、vWF因子、内皮素和内皮细胞松弛因子等； 针对血小板功能异常：血小板黏附性测定法、血小板聚集功能测定法及测定血小板释放反应活性物质，如5-HT、TXA2、ADP和血小板第四因子(PF4)等，综合评价血小板功能； 针对凝血活性增高：运用凝血时间测定方法、凝血因子活力或含量测定方法，如血浆复钙时间、凝血酶原时间、部分凝血活酶时间的测定和纤维蛋白溶解试验等。 体外血栓形成法：按照Chandler法，在体外旋转环内模拟体内血液流动状态，形成血栓； 体内血栓形成法：动脉血栓形成法，有实验性动-静脉旁路血栓形成法、电刺激颈总动脉血栓形成法、脑动脉血栓形成法、冠状动脉血栓形成、实验性肺栓塞和药物引起血栓法及下腔静脉血栓形成法等。,降 脂 实 验,高脂血症动物模型： 1、高脂饲料喂养造模：不同动物饲料有不同 2、非喂养法诱发高脂血症动物模型 免疫学方法；大鼠动脉匀浆后，给兔子注射；马血清给兔子注射；胆固醇-脂肪乳剂兔子耳缘静脉注射等。 血脂测定：总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白-胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、各型脂蛋白（HDL、LDL、VLDL）、载脂蛋白（apo，20多种）、低密度脂蛋白受体活性、LPO（脂质过氧化物）,抗血栓、抗动脉粥样硬化,血管内皮细胞功能： 选择性通透作用（引起胆固醇在血管壁沉淀，动脉硬化） 抗血栓性（健康的血管内腔面，不引起血小板粘附、聚集，释放PGI2） 血管紧张的调节：血管舒张因子（EDRF)和血管收缩因子（EDCF）来实现。 毛细血管形成：血管内皮细胞生长及形成毛细血管的过程与糖尿病增殖症、网膜症和实体癌症的增殖、慢性炎症、动脉粥样硬化等疾病的发生发展密切相关。,产生血细胞粘接因子：血管内皮细胞表面因各种炎症因子和变性的LDL的刺激，可产生各种细胞间粘附分子，引起白细胞、单核细胞、和血小板等于血管内皮细胞粘附，导致白细胞的血管外浸润和动脉粥样硬化的初期病变。,血管内皮细胞分泌,血管内皮舒张因子 血管内皮收缩因子 内皮素,实验方法 血管内皮细胞的分离培养 血管内皮细胞的损伤模型建立: 胆固醇损伤模型、氧化活性物质损伤模型、DPPH（二苯三硝基苯肼，氧化剂）损伤模型、活体血管内皮细胞损伤模型（冰、肾上腺素刺激）,分泌活性物质的测定，包括血管内皮细胞分泌功能的相关基因表达分析。,血管平滑肌细胞研究,1、血管壁生长控制 平滑肌细胞的复制增加，DNA合成增强，内皮完整性破坏，在平滑肌细胞增殖、AS形成中起重要作用。 2、血管内皮细胞对平滑肌细胞功能的调节保护；分泌物质（EDRF、PGI2、EDCF）调节平滑肌细胞的收舒功能。,Ach引起依赖内皮的平滑肌细胞舒张原理： Ach作用于ECM（细胞外基质）受体，引起精氨酸分解，产生NO-引起胞内钙离子水平下降（图） NO及超极化因子（EDHF）使平滑肌细胞超极化，胞内钙降低。 前列环素（ PGI2）：升高细胞内cGMP浓度，激活蛋白激酶A，使肌球蛋白脱磷酸化，舒张血管平滑肌。,关于AS,AS形成的主要特征之一是平滑肌细胞增生。 AS发病因素有高血压、缺氧、高胆固醇血症及血液流变学、动力学异常。 除内皮细胞核平滑肌细胞的相互作用外，血小板、白细胞、补体等也参与了AS的形成。如：高胆固醇可激活补体C5，促进白细胞和血小板在血管啊内皮细胞上聚集和粘附，致血流缓慢和通透性增高，引起血管内皮损伤，导致生长因子释放和单核细胞浸润，促平滑肌细胞增生。,血管平滑肌细胞在抗AS药物研究中的应用,正常的平滑肌细胞内丝状纤维占大部分， 引起血管收缩和舒张，称收缩型细胞。 AS病灶内的平滑肌细胞内丝状纤维 明显减少，小胞体和线粒体发达，细 胞的增殖和游走能力亢进，这种形态称合成型。 最新研究方法：用基因工程方法对血管平滑肌细胞进行肌浆球蛋白重链基因SM1导入后，观察药物对平滑肌细胞特异性的-半乳糖酶活性，在体内评价药物的抗AS作用。 体外，对经形体转换后的平滑肌细胞进行特异性的 -半乳糖酶活性测定，筛选药物。,通过对合成型细胞分化诱导成收缩型平滑肌细胞，抑制平滑肌细胞的增殖和游走。 开发：能使平滑肌细胞形态转换的药物。,降压实验,高血压模型 1、遗传性高血压模型：培育、自发性高血压模型SHR、SHRSP、GH、SBH、MHS等。 2、神经源性高血压模型 3、肾动脉狭窄性高血压模型（两侧） 4、妊高征模型：子宫胎盘缺血模型（孕狗腹主动脉钳夹） 5、内分泌模型：注射雄性激素14天，4毫克/天。,降压试验检测指标,血压：血压直接测定法、间接测定法（非创伤） 离体血管环灌流 心肌肥厚形态学指标观察：左心室重与体重的比值，左室壁厚度等。 心室胶原含量和浓度测定：求羟脯氨酸含量。1克羟脯氨酸相当于8.2克胶原蛋白。 循环-内分泌系统的指标：血浆降钙素基因相关肽、内皮素、心钠素 肾素-血管紧张素-醛固酮系统指标 NOS、NO 检测、血清细胞因子检测（TNF、IL-1、IL-2等）,呼吸系统实验（化痰止咳平喘药）,化痰试验：酚红排泌法 原理：酚酞和进入的OH-发生络合反应，生成有红色的物质 。用碳酸氢钠冲洗气管段，若酚红排泌多，冲洗处的液体颜色深，比色后统计吸光度的差异。,止咳实验：氨水引咳 平喘试验：支气管灌流、离体气管条,中枢神经系统药物实验 （安神药、平肝熄风药）,自发活动观察：吊笼法、旷野法、活动仪,睡眠实验：观察指标有潜伏期、睡眠时间（翻正反射消失时间）、睡眠发生率,抗惊厥实验：观察指标有潜伏期、惊厥程度（半定量）、惊厥发生率、死亡率,造模物质：苯丙胺、回苏灵、戊四氮、咖啡因、烟碱等。,抗抑郁、抗躁狂：神经递质检测（NADA5-HT),缺血性心脏病药效学实验（开窍药等）,一、药物诱发心肌缺血动物模型 二、冠状动脉阻断、缩窄性心肌缺血和心肌梗死动物模型 三、心肌缺血再灌注损伤动物模型 四、心肌缺血性心脏血流动力学动物模型 五、心肌缺血性冠脉循环动物模型 六、心肌氧代谢动物模型 七、体外培养心肌细胞缺血样损伤动物模型 八、心肌细胞凋亡动物模型,抗应激实验（补益药）,耐缺氧：常压、低压耐缺氧 抗疲劳：游泳法、转棒仪跑步法 耐高温：计数资料 抗寒冷： 抗辐射：,益智实验（补益药）,避暗实验 ： 跳台实验： Morris水迷宫实验：定位航行实验 、空间探索实验,免疫系统实验（补益药等）,免疫器官增重：脾脏、胸腺、法氏囊（禽类特有的免疫器官） 免疫指标： 白细胞数量、吞噬功能（动物碳廓清能力、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力）、补体、溶菌酶、干扰素含量等。,免疫试验指标,二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应 （通过T细胞、中性白细胞、巨噬细胞引起的细胞损害） 淋巴细胞数量（T、B）、转化率 ConA诱导的动物脾淋巴细胞增殖能力 动物血清溶血素含量 抗体生成细胞能力 NK细胞活性 白介素-2：是诱导淋巴细胞DNA合成过程中促进其生长增殖的重要因子,经绵羊红细胞（SRBC）免疫动物的淋巴细胞可产生抗SRBC抗体（溶血素），并释放至外周血。这种抗体在试管内与SRBC温育，在补体参与下可产生溶血反应，免疫动物血清中溶血素的含量可以通过溶血过程中释放的血红蛋白来测出。,NK 细胞,来源于骨髓，分布于淋巴结、脾脏和外周血，在机体防御及肿瘤监视中起重要作用。 NK 细胞活化后即可释放抗肿瘤坏死因子（TNF- ）、IL-2、干扰素（IFN -）等细胞因子，并呈正向调节作用，进一步调节巨噬细胞的功能,抗肿瘤作用实验,移植性肿瘤整体动物实验法 动物：裸小鼠和C57BL/6小鼠 疗效评价： 药物对实体瘤的抑制率。 肿瘤抑制率=对照组瘤重-药物组瘤重/对照组瘤重*100% 当中药的瘤重抑制率30%时，需重复实验，连续数次疗效稳定，统计有意义，再评价疗效。 也可测肿瘤体积。,免疫缺陷，对异种移植不产生排斥。不用于初筛，价格高。,黑毛，对药物敏感性好，研究Lewis肺癌。多用于初筛,治疗期间给药组小鼠死亡率20%或平均体重下降（自身对照）超过15%，提示药物有毒。,腹水瘤疗效评价： 对照组在2-3周内死亡。药物组观察50天 生命延长率=治疗组平均存活天数-对照组平均存活天数/对照组平均存活天数*100% 非ip给药，生命延长率50%，ip给药生命延长率75%，有苗头，连续重复3次，疗效稳定，可结论。,治疗期间对照组动物死亡 20%或其20%存活时间长于4周以上，实验均作废。,测量方法：每天称重,抑制肿瘤增殖作用的体外试验方法,体外细胞培养：药效检测、细胞毒性研究。 优点：条件可控，直观，经济，普筛，考察是直接作用或间接作用。 缺点：内外环境的巨大差别。 评价指标：药物对细胞形态的影响、细胞膜功能的改变、克隆形成的减少、生长曲线的变化等。 注意：单一指标有不足之处，将几种指标结合起来研究，综合评价。,MTT法,又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。,四氮唑（噻唑蓝）,抑制诱癌作用的观察,实验性肿瘤诱发：指用化学、物理、生物的致癌因子在动物机体诱发出各种类型的肿瘤。 用此类实验可验证可疑致癌因素，也可评价药物对致癌因子的作用。 诱癌模型建立要考虑的三条因素 动物对致癌物的敏感性 动物对致癌物剂量的反应性 动物对饲养条件的反应性（饲料中的营养成分影响诱发结果。维生素B2，影响奶油黄诱发肝癌） 注意安全：实验环境通风，给药在通风橱内，防护措施。,常用的诱癌方法,涂抹法诱发皮肤癌（背侧或耳部皮肤），诱发上皮类肿瘤或二阶段皮肤乳头状瘤。 经口给药诱发胃癌（饮用或灌胃） 体外诱癌模型建立 细胞培养-致癌物处理-弃掉致癌物培养液-癌化细胞的分离、克隆-细胞癌化的检测。（形态、生长曲线、倍增时间、恶性度分析等）,抗肿瘤转移作用实验,颈动脉注射方法移植癌细胞（血行性转移）、肺转移、皮下或肝转移 几乎所有的脏器与组织的转移模型都有报道 人工转移和自然转移 转移性癌细胞开发：肿瘤细胞不一定都具有转移能力，形成了的肿瘤，也不一定具有转移能力，可转移的，转移能力与转移脏器的特异性也有别。 选择适合实验目的的肿瘤细胞和方法。 粘附是肿瘤细胞与宿主细胞或细胞外基质以及肿瘤细胞之间通过特异性受体识别，结合并相互粘连的过程。 转移：从原发灶脱落-浸润到靶目标组织-通过基底膜 对基底膜的粘附-造成基底膜构成成分的破坏-把基底膜成分作为浸润对象。,抑制肿瘤血管新生的实验方法,鸡胚尿囊膜血管新生观察 血管生成抑制率=对照组血管面积-药物组血管面积/对照组血管面积*100% 抑制血管内皮细胞的增值，游走作用观察 血管新生，首先是血管内皮细胞的增殖（人的血管内皮细胞是处于静止期不增殖的）。肿瘤细胞分泌活性因子，刺激血管内皮细胞增生。 观察药物对血管内皮细胞增殖、游走的作用。,肿瘤在没有养分的供应下，只能长到23立方毫米，一旦有新生血管与其相连，肿瘤获得营养，就会以几何级数迅速生长，同时肿瘤细胞还可以通过新生血管转移到其他器官，引起肿瘤转移，导致人体死亡。因此，血管新生对肿瘤研究具有重要意义。,诱导癌细胞凋亡作用,诱导细胞凋亡的因素：细胞毒药物激素、细胞因子、抗体、超抗原、粘附分子、免疫细胞、化疗药物、致癌物、生长因子缺失、高温、放射线。 紫外线、射线导致DNA损伤引起细胞凋亡； 激素对淋巴细胞有诱导凋亡作用(调节凋亡相关基因) 细胞因子TNF可与某些靶受体上的TNF受体作用引起细胞凋亡； 细胞毒药物，干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等，诱导凋亡； 微生物因素，细菌、病毒等致病微生物及毒素课诱导细胞凋亡。如HIV感染，可致大量CD/淋巴细胞凋亡。,逆转肿瘤耐药性作用,肿瘤细胞耐药分为：先天性耐药和获得性耐药。 耐药机制：多药耐药基因MDR编码的P-糖蛋白高表达。多药转运系统（或P糖蛋白）：由人体多药耐药性基因编码表达的能量依赖性药物排出泵，能泵出有效天然的细胞毒药物（多柔比星、柔红霉素、长春新碱、长春碱、紫杉醇等） 多药耐药性：肿瘤细胞运用多药转运系统方式引起的对抗肿瘤药物的耐药性称“多药耐药性”。,“芦荟逆转食道癌细胞多药耐药性的实验研究 及机制探讨”,研究背景：肿瘤细胞对多种化学药物产生交叉耐药性，称“多药耐药”（MDR），是造成肿瘤化学药物治疗失败的主要原因。统计表明，肿瘤年死亡率中，属内在性多药耐药的肿瘤，约占61%；属获得性多药耐药的肿瘤约占33%，因此，肿瘤耐药与逆转多药耐药成为肿瘤治疗亟待解决的问题。 本项课题的内容是通过研究芦荟大黄素（Aloe Emodin，AE）对食道癌细胞株A549及A549/DDP的细胞毒性，确定芦荟大黄素的无细胞毒性浓度；检测此浓度的芦荟大黄素能否逆转A549/DDP株细胞对顺铂的耐药性，并初步探讨其可能的机制。,一、研究方法如下： 1、取对数生长期A549、A549/DDP细胞，设立芦荟大黄素组：浓度为2.5 gmL-1、5 gmL-1、10 gmL-1、15 gmL-1、20 gmL-1；阴性对照组：加培养液；溶剂对照组：0.1二甲基（Diaminobenzidine，DMSO）和空白对照组：不加细胞。用MTT法检测芦荟大黄素对A549及A549/DDP细胞作用24 h、48 h、72 h的细胞毒作用，确定芦荟大黄素作用48 h无细胞毒性浓度。 2、用顺铂（浓度为：0.125 gmL-1、0.25 gmL-1、0.5 gmL-1、1.0 gmL-1、2.0 gmL-1、4.0 gmL-1、8.0 gmL-1、16 gmL-1、24 gmL-1、32 gmL-1）分别处理A549、A549/DDP细胞48 h，MTT法检测抑制效应，并求出A549/DDP对DDP耐药倍数。 3、MTT法检测无细胞毒性浓度芦荟大黄素与顺铂（浓度为：0.125 gmL-1、0.25 gmL-1、0.5 gmL-1、1.0 gmL-1、2.0 gmL-1、4.0 gmL-1、8.0 gmL-1、16 gmL-1、24 gmL-1、32 gmL-1）联用对A549/DDP的抑制效应，求出芦荟大黄素对A549/DDP耐药逆转倍数。 4、无细胞毒性浓度的芦荟大黄素对A549/DDP株细胞生长曲线及倍增时间的影响。 5、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法测定A549和A549/DDP细胞内顺铂浓度，初步探讨芦荟大黄素逆转多药耐药可能的作用机理。,二、通过以上研究取得了以下研究成果： 1、MTT比色法结果显示：AE可明显抑制体外培养的A549株和A549/DDP株细胞的增殖，且抑制程度随芦荟大黄素作用时间和浓度的增加而增加，呈一定的时间、剂量（2.5-20 gL1）依赖性，表明AE本身有细胞毒性作用，能抑制食道癌细胞的增殖；低于或等于5 gmL-1的AE作用48 h对A549和A549/DDP两株细胞均无明显毒性（IR10%），将5 gmL-1确定为AE的无细胞毒性浓度。 2、 A549细胞的IC50为1.344 gmL-1，A549/DDP细胞的IC50为16.81 gmL-1，A549/DDP耐药倍数为12.51倍；无细胞毒浓度（5 gmL-1）AE与DDP合用时， A549/DDP细胞的IC50降为5.86 gmL-1，逆转倍数为2.87，说明AE增强了DDP对A549/DDP株细胞的杀伤作用，即与DDP合用时，能恢复DDP对A549/DDP细胞的敏感性，表明AE具有化疗增敏作用，与细胞计数绘制生长曲线结果相一致。 3、电感偶合等离子质谱法结果显示：无细胞毒浓度（5 gmL-1）AE与4 gmL-1DDP合用后，能显著增加A549/DDP株细胞内DDP的积累，而未见显著增加A549细胞内DDP的积累。,三、研究成果的科学意义和应用前景 研究发现AE对A549株和A549/DDP株细胞的生长有明显的抑制作用，且随AE浓度及作用时间的增加而增加，生长抑制率呈药物浓度-时间依赖方式。表明AE本身对两株细胞有增殖抑制作用；在5 gmL-1为AE的无细胞毒性浓度。此浓度的AE能明显增强DDP对人食道癌细胞耐药株A549/DDP增殖抑制作用，表明AE有部分逆转A549/DDP细胞耐顺铂的作用且其逆转耐药的作用，与增加细胞内药物浓度有关。此研究结果表明芦荟不仅具有抑制肿瘤的作用同时还具有抗MDR的作用，为进一步开发芦荟成为临床多靶点抗肿瘤新药提供了实验室的依据，为进一步开发芦荟提供了理论支持。,抗衰老、抗痴呆,皮肤老化主要原因：ROS和过氧化脂质等的过量导致皮肤细胞成分的损害。 外源性的原因：紫外线、温度、适度、环境污染等。 判断标准：皱纹，但内在的是判定细胞老化的水平。 研究部位：表皮的角化细胞或成纤维细胞。,ROS,需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇( reactive oxygen species， ROS)，包括：O2 -、H2O2 及HO2、OH 等。 中、高浓度的ROS 通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。随着自由基生物学研究的发展，研究者们逐渐认识到ROS 可双向调控某些肿瘤细胞的凋亡和增殖，并发现了自由基与细胞信号转导之间的内在关联。 最新研究发现，低浓度的自由基能够影响一系列信号转导途径。机体内的自由基通过其浓度调节着机体细胞的生死平衡，除了引起细胞凋亡、坏死的功能，低浓度的ROS 更广泛的生理意义在于其对转录因子的激活以及对细胞增殖、分化的促进。,抑制自由基作用的实验,自由基损伤细胞的体外模型 自由基测定：血清中过氧化脂质、组织中过氧化脂质、脂褐素、羟自由基、过氧化氢、超氧化物岐化酶 氧化应激相关基因NF-B（核转录因子）的检测 当细胞受到自由基作用，在氧化应激状态下， NF-B向核内移动，与核内基因序列上的特异性调控区结合，激活受调控的基因表达。,清除自由基： 实验指标:SOD 、MDA 、LPO 、MAO 脂褐素 H2O2,过氧化脂质。自由基使脂质发生