临床标本的微生物检验（二）.ppt

临床标本的微生物检验（二）,程曦 检验医学院,复习提问,1. 试述血液标本的细菌学检验 2. 脑脊液的检验包括哪些方面,主要内容,1.呼吸系统感染的微生物学检验 2.消化系统感染的微生物学检验 3.泌尿系统感染的微生物学检验,要求,1.痰液标本采集和验收、检验程序、检验方法（标本的直接涂片检查、分离培养与鉴定）。 2.粪便标本的检验程序、检验方法（标本的分离培养与鉴定）。 3.尿液标本的检验程序、检验方法(计数)。,第一部分 呼吸系统感染的微生物学检验,概述,按解剖结构通常将呼吸道分为上呼吸道和下呼吸道。 上呼吸道包括喉及喉以上呼吸道； 下呼吸道包括气管、支气管和肺泡。,上呼吸道感染细菌学检验,上呼吸道正常菌群种类,上呼吸道感染的常见病原菌,微生物学检查,鼻咽拭子,标本的采集,鼻咽拭子：用无菌棉拭子直接擦拭咽后壁、扁桃体或假膜边缘处。口腔内溃疡用无菌棉拭子直接在溃疡处采集标本。用无菌棉拭子插入鼻孔约2.5cm，接触鼻粘膜采集鼻拭子。 注意：立即送检，防干涸，注意无菌操作，减少杂菌污染。,直接显微镜检查,将脓性物或分泌物标本直接涂于两张洁净的玻片上，一张做革兰染色，另一张根据情况做抗酸染色等其它染色并进行镜检。咽拭、鼻咽部标本的细菌检验应结合临床才有助于临床诊断。,分离培养 细菌鉴定 药物敏感性试验,微生物检验注意事项,1. 病原体检测只对某些疾病诊断具有意义。由于菌群复杂，正常寄生菌和种类繁多，一份咽拭子分离出来的细菌不一定与疾病有关，另外由于接受药物治疗，使某些细菌受到抑制，可影响阳性检出率。因此，在分析结果时应紧密结合临床。,2. 鼻咽拭子标本的检测有助于猩红热、风湿热、急性肾小球肾炎病人的临床诊断；还可检出化脓链球菌、奋森螺旋体、脑膜炎奈瑟菌、麻风杆菌等以协助诊断；对白喉、百日咳或口腔念珠菌感染的诊断有意义，应结合临床。,3. 上呼吸道感染多为病毒引起，常见普通感冒或流行性感冒，咽炎和扁桃腺炎等，均应结合临床 进行诊断。,下呼吸道感染常见于细菌性肺炎、支气管炎、肺脓肿、肺结核、真菌、支原体肺炎及病毒性肺炎等。,下呼吸道感染常见病原菌,下呼吸道感染常见病毒： 腺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒等。,一,检验流程图,自然咳痰法：以晨痰为宜，咳前充分漱口，减少口腔正常菌群污染，痰置于无菌容器中送检。 气管镜采集法：于病灶处用导管吸引或气管刷收集，因此法患者较痛苦，不常采用 。,标本采集,气管穿刺法：主要用于厌氧培养的标本采集。 胃内采痰法：部分结核病人，尤其是婴幼儿患者不会咳嗽，且有时把痰误咽入胃内，清晨空腹时，可采用胃内容物作结核杆菌培养。 *有1/4到1/2的肺部感染病人可能发生菌血症，可同时作血培养。,标本质量的估计,判定是否下呼吸道痰，一般认为合格的痰标本应是含白细胞、脓细胞和支气管柱状上皮细胞较多，而受污染的痰标本则是来自颊粘膜的扁平鳞状上皮细胞较多。 痰标本培养前应作涂片镜检，白细胞25个/低倍镜视野，而鳞状上皮细胞10个/低倍视野为合格标本。,直接显微镜检查,将痰标本涂片后待干，固定、染色，或直接湿片镜检，对病原学早期、初步诊断有价值。,支气管分泌物等要离心沉淀，以生理盐水适当稀释后,直接涂片染色镜检: 1)正染色法：适用于多种标本及培养物，将标本固定于洁净玻片上直接 染色。常用革兰染色，苏本索一伊红染色(HE)，乳酸酚棉蓝染色，过碘酸锡夫染色(PAS)，嗜银染色(GMS）等;,2)负染色法：用真菌不着色而使背 景着色,检查新型隐球菌，如用 墨汁负染色镜检找隐球菌。,分离培养与鉴定,一般要求下呼吸道感染培养的细菌浓度应107CFU/ml，可视为病原菌，104CFU/ml可视为污染菌。若介于两者之间如105106CFU/ml时，要连续分离培养两次以上，仍为105106 CFU/ml时，亦认为是病原菌。,痰培养标本的前处理：一般是用无菌生理盐水将痰洗涤3次，主要是洗去痰中的常居菌，然后向痰液内加入等量的（pH7.6）1%胰酶溶液，放置3790min即可使痰液均质化后备用。,分离培养：用处理后的痰接种于血琼脂平板，巧克力琼脂和麦康凯琼脂平板。置于5%10%CO2中，35培养1824h，观察菌落生长情况，选不同单个菌落作涂片，染色镜检，根据形态特点，作出初步印象，然后按各类细菌的特征做生化鉴定及药敏试验。,如何出报告?,特定的致病菌和正常菌 上呼吸道：百日咳鲍特菌、白喉棒状杆菌（法定报告的传染病）、A群化脓性链球菌、脑膜炎奈瑟菌 下呼吸道：肺炎支原体、军团菌、双相型真菌、Tb,初级报告：涂片染色镜检的描述性报告（发现有诊断价值时应及时报告） 最终报告：包括肉眼观察送检标本的记录、涂片革兰染色细胞学和镜检的描述性报告、分离致病菌的鉴定结果、药敏试验和评述性建议等，同时根据三区划线细菌生长情况报告细菌半定量的量化指标。 三区划线细菌生长菌落量化指标：纯培养、大量、中等量、少量和个别,临床意义,1.下呼吸道感染指肺实质性炎症的肺炎和支气管粘膜炎症的支气管炎，是病死率高的疾病。近几年来呈上升趋势。,2.细菌学检查对诊断有重要意义， 采集痰要来自于下呼吸道合格 的标本，提高检出率和阳性的 正确率。,3.细菌性肺炎为最常见的类型，肺炎链球菌所致仍为常见，由流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌、MRSA和G-杆菌所致肺炎比例明显上升，军团菌肺炎引起了重视。在医院感染中，条件致病菌和耐药菌的G-杆菌占50以上，成为医院内肺炎的主要致病菌。,4.支原体肺炎常以不典型肺炎表现，近年发生率上升, 约80的慢性气管炎病人合并有支原体感染。约占肺炎的10-20 。,5.真菌性肺炎是致病性真菌和条件致 病性真菌所引起。目前以条件致病 性真菌感染致病为主，并呈上升趋 势，以白假丝酵母菌为主，毛霉、 曲霉和隐球菌也常见。常合并多种 细菌感染。,第二部分 消化道感染的微生物学检验,常见的病原体,1.肠毒素为主的病原菌： 霍乱弧菌、志贺菌(福氏、宋内)、 大肠埃希菌(ETEC、EHEC、EAggEC)、 金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌。,2.侵袭性为主的病原菌： 沙门菌、大肠埃希菌(EPEC、EIEC )、 志贺菌(鲍氏、志贺)、弯曲菌、副溶 血弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、结核 分枝杆菌、白假丝酵母菌。,3.病毒 轮状病毒、埃可病毒、Norwolk 病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病 毒、腺病毒。,一般实验室检查,1.镜下不染色直接检查 2.隐血试验 3.电镜检查 4.其它,标本采集,腹泻患者：使用抗生素前采集脓血粘液或稀便2-3或1-2ml或肛拭无菌试管甘油盐水保存液增菌培养基。 食物中毒者：采集可疑食物、呕吐物、胃液、粪便等。 消化道溃疡：取胃窦和胃体粘膜活检标本各一块置无菌NS立即送检，或将标本放于运送培养基，4保存，24h内送检。,病原学检验程序,采集脓血或糊状新鲜粪便，应在急性期，使用抗生素前进行。肠道细菌多为G-杆菌，形态区分困难，不做涂片镜检。,直接显微镜检查,一般不做，对一些特殊病原菌感染才做。如疑为霍乱弧菌、结核杆菌、幽门螺杆菌、葡萄球菌、艰难梭菌、弯曲菌、副溶血弧菌、真菌感染时，才做直接涂片革兰染色镜检。,油镜观察球杆比,菌群分析结果为革兰阳性球菌（10-20%），是由于大量使用头孢菌素导致肠道菌群失调。 当菌群分析结果为革兰阳性杆菌（30-50%），可能是由于艰难梭菌所致的伪膜性肠炎，主要是抗生素的大量应用所诱发。 当菌群分析结果为革兰阴性杆菌且形态一致（40-70%），往往是由于痢疾杆菌感染。,分离培养与鉴定,粪便GN增菌液（志贺菌）亚硒酸盐或四硫磺酸盐增菌液（沙门菌）SSMac平板 3518-24h可疑菌落（无色） G-b、氧化酶(-)、KIA MIU、药敏试验 鉴定（血清学多价单价） 最终鉴定。,疑为沙门菌、志贺菌感染肠道普通培养和鉴定方法：,疑为致病性大肠埃希菌,粪便标本 增菌Mac平板3518-24h挑取5个红色菌落KIA、MIU 初步鉴定为大肠埃希菌、再根据肠毒素血清学和侵袭力等试验对ETEC、EIEC、EPEC、EHEC、EaggEC进行分型鉴定。,疑为空肠弯曲菌,粪便弯曲菌选择平板43微氧48-72h可疑菌落,疑为小肠结肠炎耶尔森菌,粪便NYE平板22-2548h可疑菌落（扁平、无色、半透明小菌落）KIA、MIU鉴定，25动力+，37动力- 若把粪便标本在1/15 mol/L PBS(PH7.4-7.8)中4冷增菌21天再进行分离培养，可提高其阳性检出率。,疑为艰难梭菌,粪便CCFA平板厌氧培养37 48h可疑菌落G+b、耐氧试验（-)，再做进一步鉴定。,疑为金黄色葡萄球菌,粪便高盐甘露醇琼脂平板35 18-24h黄色菌落G+C、成堆排列似葡萄状。 生化：血浆凝固酶+ 甘露醇发醇+、肠毒素+,疑为幽门螺杆菌,粘膜组织块巧克力平板等 可疑菌落（无色半透明露滴状，或沿接种线扩散生长，融合成片，扁平，无色半透明）。快速脲酶试验+。,疑为霍乱弧菌,米泔样大便 直接镜检（悬滴法）：穿梭样运动 鱼群状排列 碱性蛋白胨水生长、生化、血清学鉴定,疑为真菌感染,常发生于抗生素治疗之后出现的腹泻，一般为肠菌群的失调，而后由假丝酵母菌（白色念珠菌）引起的二重感染。,临床意义,1感染性腹泻 最为常见，为胃肠炎的症状，由多种病原体感染所致。 2细菌性痢疾是指由志贺菌属(福氏和宋内氏)引起的肠道传染病。常有里急后重和脓血样便，中毒性痢疾见于小儿。发病率呈下降趋势。粪培养对诊断有价值。,3细菌性食物中毒常见于沙门菌、副溶血弧菌、致病性大肠埃希菌、葡萄球菌、肉毒梭菌、腊样芽胞杆菌食物中毒。多发生在夏秋季，以暴发和集体发病为特征。,4致病性大肠埃希菌的肠道感染分为5类，即ETEC可致霍乱样肠毒素水泻，常见于儿童和旅行者腹泻；EPEC可引起婴幼儿腹泻；EIEC可引起志贺菌样粘液脓血便；EHEC的0157：H7血清型可引起出血性肠炎和溶血性尿毒综合征；EaggEC是新近报道可引起慢性腹泻的大肠埃希菌。,5消化性溃疡 幽门螺杆菌感染主要部位是胃及十二指肠球部。大量研究及临床证明胃炎、消化性溃疡主要是HP所引起，HP可能还参与了胃癌的形成。从此消化性溃疡经抗感染的治疗而成为一个新的概念，并取得更好的疗效。,6近年来胃肠炎的病毒感染呈上升的 趋势 (1)轮状病毒常引起幼儿腹泻； (2)腺病毒是引起儿童腹泻的主要病原， 还可引起成人腹泻； (3)Norwolk病毒常感染成人和大龄儿 童，引起水样便或黄稀便的腹泻； (4)埃可病毒常引起婴幼儿腹泻。,结果报告及解释,1.阳性：细菌种名（血清型）及药敏结果 2.阴性：常规细菌培养阴性应该报告“未检出沙门菌、志贺菌、气单胞菌、邻单胞菌、迟缓爱德华菌（沿海地区加报弧菌），未检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及酵母菌过度生长”；特殊细菌培养阴性时应报告相应细菌的阴性筛选结果，如：“弯曲菌培养阴性”。,第三部分 泌尿系统感染的微生物学检验,概 述,尿路感染(urinary tract infection)是指大量微生物在尿路中生长繁殖而引起的尿路炎症。可分为上尿路感染（主要有输尿管炎和肾盂肾炎）和下尿路感染（主要有膀胱炎和尿道炎）。尿路感染为最常见的感染性疾病，发病率约占人口的2%，多见于成年女性。,正常人的尿液是无菌的，但可能被泌尿生殖道口的正常菌群所污染，因此从尿液中分离出一定数量的病原菌是诊断尿路感染的重要依据。 引起尿路感染的病原体主要是细菌和真菌，绝大多数是单一病原体感染，少数是2种或以上病原体混合感染。,感染途径,上行感染：最常见 血行感染 淋巴感染 直接感染,诊 断,症状与体征 ：膀胱刺激症状、血尿、全身中毒症状、局部特有症状 尿液常规：3个WBC/HP 细菌培养: G-105CFU/ml，加药敏可指导临床用药 感染定位：判断出感染部位不同，治疗预防不同。方法包括：有创和无创检查 影像学检查：主要目的判断有无泌尿系畸形、梗阻、是否合并结石、肿瘤、神经源性病变或其他疾病,常见病原菌,80%为革兰阴性杆菌，其中以大肠埃希菌最为常见，占尿感的70%以上，其次为变形杆菌、铜绿假单胞菌、克雷白杆菌、肠杆菌、沙雷菌、产气杆菌、沙门菌等； 20%为革兰阳性菌，其中以肠球菌为多见，次为葡萄球菌、粪链球菌、结核分枝杆菌，少数为厌氧菌等； 支原体、衣原体、真菌感染呈上升趋势； 急性尿感多见于大肠埃希菌,慢性尿感多见于变形杆菌和铜绿假单胞菌。,检验方法,一般实验室检查 尿常规11项 尿沉渣 尿量,标本采集,清洁中段尿 清洗外阴部或者尿道口，用灭菌水冲洗，然后取中段尿10ml，立即送检，2h内接种培养基。如无法2h内送检，则放置于4度冰箱，不应超过24h。 导尿或膀胱穿刺留尿标本,注意事项,尿标本采集后应立即送检（RT不超过2h），以免污染 要在未用抗生素前采集标本 尿液中不得加防腐剂和消毒剂,检验程序,直接显微镜检查,可用新鲜清洁中段尿1滴涂片作革兰染色，用油镜观察细菌。如平均每个视野10个细菌（表示细菌定量培养105 CFU/ml），也可取尿液10ml，置于灭菌离心沉淀管内离心，取沉渣涂片染色镜检。,分离培养与鉴定,用清洁中段尿做细菌培养，菌落计数，其结果才有诊断意义。,尿液细菌定量培养,倾注平板法-方法,倾注法和涂布法菌落计数,连续稀释,倾注平板法-结果,选择菌落数在30300之间的平板作菌落计数。 每毫升尿液中的细菌数=菌落尿液稀释倍数,注意事项,若革