免疫组织化学技术进展及应用ppt课件

免疫组织化学技术进展及应用,山西医科大学第二医院病理科 张晓琴,一、免疫组织化学技术的概念,免疫组织化学技术是利用抗原与抗体的特异性结合，并利用酶作用于底物，发生一系列化学反应显色，借助显微镜观察着色部位，从而鉴定组织或细胞结构的化学成分和化学性质的技术。,抗原：是一类在合适条件下，能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答所产生的效应物质（包括抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。其两种性能a免疫源性b反应源性,抗原决定簇：又称抗原表位，决定抗原的特异性，是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位，是决定和控制抗原特异性的特殊化学基团。,抗体：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖、分化成为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白（凝集素、调理素、沉淀素）。,抗体大部分位于r区带。r球蛋白并非都有抗原活性。免疫球蛋白是包括了抗体和化学结构与抗体相同或相似，但却无抗体活性的异常球蛋白,用以做标记的物质：生物素、地高辛、胶体金，荧光素、酶、同位素等。其中用于标记的酶有辣根酶、碱磷酶、葡萄糖氧化酶等等。,根据酶标记的对象的不同： 直接酶标法：将酶直接标记在特异性的抗体上。 间接酶标法：将酶标记在特异性抗体之外的其他参与反应的物质上。,根据酶在反应过程中扮演的角色不同： 酶标抗体法 抗原抗体酶标二抗显色 非标记抗体酶法 抗原抗体抗酶抗体酶显色 如：PAP法、APAAP法,那么，现在又根据免疫组化方法中是否有生物素的参与，我们又把免疫组化试剂分为生物素检测系统和非生物素检测系统,其实，现在的多数的免疫组化方法，是多种技术的有机的融合，它吸取了各种免疫组化理论基础的优点，使免疫组化技术更趋向于成熟和稳定，更方便于广泛的运用。,作为一个高水平的技术员，而不仅仅是一个操作工，应该认真学习弄通免疫组化技术的理论和原理，才能在实际工作中从容应对随时出现的问题，做到以不变应万变。,到目前为止，最广泛的用于病理组织学诊断和临床科研的免疫组化方法是我们今天重点介绍的SP法和Elivision法,这两种方法所用的标记酶均为过氧化物酶（Peroxidase）,三、最常用的免疫组化染色法,1：SP法 2：Elivision法,1：SP法,主要是利用了生物素（biotin）与链霉菌抗生物素蛋白（S-avidin）之间具有的高度的亲合力。,生物素和抗生物素蛋白是自然界中具有最强结合力的物质之一，并且它们同时和抗体或酶交联，并不影响它们的生物学活性。而SP法正是利用了他们的这一特性，同时，每个S-avidin分子具有的四个亚单位，这种特殊的结构使的抗原抗体结合的信号可以有效的呈多级放大，便于我们的镜下观察，有利于我们作出阳性的判断。这就是我们常说的三步法。,主要操作步骤如下： 在组织切片或细胞片上加入特异性的一抗 其次，加入生物素标记的二抗 随后，加入与过氧化物酶交联的链抗生物素蛋白（即所谓的三抗）。 最后DAB显色,SP法反应原理示意图,被检测抗原,特异性一抗,生物素化二抗,抗生物素蛋白-HRP,DAB显色,2：Elivision法,是应用了多聚物技术的最新一代免疫组化非生物素检测系统，它利用高分子葡聚糖或有机单位小分子直接将二抗的免疫球蛋白与过氧化物酶联结成多聚体形式。使每一个抗体分子与多个酶分子相连，直接放大了抗原抗体结合的信号，替代了传统SP法中的二抗三抗。这就是所谓的二步法。,主要操作步骤如下： a）在组织切片或细胞片上加入特异性的一抗 b）第二步，加入二抗过氧化物酶多聚体。DAB显色。,Elivision法反应原理示意图,特异性一抗,被检测抗原,二抗-HRP多聚物,DAB显色,四、SP三步法与Elivision二步法的比较,SP三步法的产生和建立远早于Elivision二步法，是经过多年的实践并得到不断完善的染色方法，它灵敏度高，特异性强，价格相对低廉，用于病理诊断及科研多年，在各级规模医院中被广泛应用，得到了普遍的认可。正是由于这种方法的建立，发展和壮大了免疫组化技术在医学领域中的运用范围。使免疫组化技术得以广泛的普及。,但不可避免的是它也存在着很多的缺点，比如：操作步骤较烦琐，实验时间长；另一方面，由于它运用了生物素-链抗生物素蛋白系统，而人体组织中，特别是肝、肾脑等组织中都有较高的内源性生物素，加上实验过程中所必需的抗原修复也可导致内源性生物素的激活，最终使得非特异性的背景着色在某些组织中显得尤为突出，从而影响结果的判断。,而Elivision二步法是90年代中期兴起的一种新的免疫组化检测系统，由于这种方法舍弃了传统的生物素-抗生物素系统，直接将二抗和过氧化物酶通过载体联合，形成一个同样可呈多级放大的多聚物，不仅降低了由于内源性生物素所导致的背景着色，而且减少了操作步骤，具有简单、快速、敏感等优点，使免疫组化技术趋向于简单化、方便化，是免疫组化技术的又一次飞跃，,更高的敏感度，更好的染色效果逐渐被病理技术工作者所认可。同时操作的简单化，减少了烦琐的操作过程中所带来的染色结果的偏差和影响，更有利于免疫组化技术的标准化。,四、SP三步法与Elivision二步法的比较,SP法 灵敏度高，特异性强 信号放大效果好 价格相对低廉 操作步骤较烦琐，实验时间长 不能防止内源性生物素的干扰,Elivision法 灵敏度高，特异性强 信号放大效果好 价格相对偏高 操作步骤简单，实验时间短 可以防止内源性生物素的干扰,五、免疫组化染色的自动化,随着免疫组化技术的不断普及和发展，更多的基因蛋白检测抗体的问世，还有它日益在临床诊断治疗中的广泛的运用，向我们提出了更高的要求，不仅要作到快速准确，定性定量，还要向高质量高标准方向发展，使免疫组化染色检测走向更高的质量控制阶段，提高结果的可信度、稳定性、可重复性，提高实验室之间的重现性 。,敏度灵,而免疫组化的自动化无疑又将使我们的免疫组化技术向前发展一步。由于全封闭自动化控制替代了传统的手工操作，确保每批染色结果的一致性和重现性，极大地减少了人工操作中出现误差的几率，因此，在不久的将来，它将推动免疫组化标准化的进程。,六、免疫组化染色技术的应用,在常规的病理诊断中，大多数病例是可以在普通的HE切片上作出明确的形态学诊断的，但也有约5-10%的特殊病例需要应用免疫组化染色来解决这一难题，特别是某些病例还需作出详细的分型以指导临床的治疗，以及预后的判断。,与病理诊断相伴随的是，更多的基因蛋白检测抗体的不断问世，免疫组化技术在肿瘤及其它疾病的病理、病因等诸多方面的研究也在不断走向深入，有力地促进了各学科领域的进展，在医学研究中发挥着不可忽视的作用。,归纳以下几条： 1：肿瘤良恶性的判断 2：肿瘤的分类和分型 3：指导肿瘤的临床治疗及预后判断 4：显示组织中的特殊成分 5：病原体的检测 6：用于肿瘤及其它疾病的组织学研究。,ER PR CerbB2：ER PR阳性的乳腺肿瘤患者大多对内分泌治疗有效，缓解率高，复发率低，预后好。即使ER/PR中只有一项阳性的患者，其预后也好于两项全阴性的患者。CerbB2基因过度表达和扩增见于多种肿瘤，与肿瘤的分化程度和分级有密切关系，是肿瘤预后的参考指标，ER PR CerbB2三者同时阳性表达的患者进行三本氧胺治疗无效。ER PR阴性，CerbB2阳性的患者可用基因靶向药物赫赛汀治疗,P53100,ER100,PR100,Her-2100,胃肠道间质瘤CD117阳性患者可用基因靶向药物格列威进行治疗。,EGFR（上皮生长因子受体）：表达于多种正常组织，特别是复层上皮和鳞状上皮的基底层。乳腺癌病人EGFR的过度表达，预示其生存期短，激素疗效差。西妥昔作为一种单抗抗肿瘤药物是EGFR的抑制剂，它可以结合肿瘤细胞EGFR位点，抑制肿瘤细胞增殖旁路，抑制肿瘤生长并促其凋亡。,VEGF（血管内皮生长因子）：在体内可诱导血管新生。作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。在肿瘤组织的血管形成中发挥重要作用。与肿瘤的生长，浸润和转移密切相关。,七、免疫组化操作中的细节问题及注意事项,1：组织的前期处理是做好免疫组化染色的保证。如固定及时与否、固定充分与否、脱水透明过分与否等，这些因素可使组织结构不清晰，抗原弥散，造成假阴性或假阳性。脱片。,2：载玻片需防脱片处理。,3：切片需4微米，裱贴牢固，没有气泡，烤片充分,4：脱蜡、脱二甲苯以及酒精等每一个步骤，要彻底干净。,5：熟悉免疫组化步骤及每一步的意义所在,6：注意一抗、二抗、所用标记酶及显色剂是否相互匹配。,7：抗体为高浓度的原液时，有必要对抗体的稀释度及反应时间进行摸索。,8：根据免疫组化方法的