细菌的形态结构观察和染色

实 验 一,细菌的形态结构观察和染色,目的要求,观察细菌菌落的特征。 掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理及操作步骤。 在油镜下观察细菌个体的形态。 了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽孢、荚膜及鞭毛染色。 了解环境微生物的检查。,安全事项,微生物 酒精灯 灭菌锅 玻璃器皿 超净台（紫外线） 电器（电炉、微波炉） ,奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜,镜筒,物镜转换器,载物台,载物台调节钮,粗调节器,细调节器,电源,光强调节钮,孔径光阑,视场光阑,双筒目镜,摄像头,物镜,镜座,镜臂,荧光发射装置,奥林帕斯生物显微镜的使用方法,接通电源。 打开主开关。 转动光强调节钮，使亮度适中。 把标本固定在载物台上。 用低倍物镜，旋转粗调和微调来进行对焦。 调节双目镜筒间距和视度差。 再适当调节照明度。 使焦点正确地对准标本。 调节孔径光阑。 依次用低、中、高倍镜观察。,油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，下降载物台，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，再细调至看清物象为止。 换片：另换新片，必须从第9条开始操作。 观察完毕，下降载物台，取下载物台上的载玻片，将4的目镜对准载物台，再用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦镜纸沾取少量乙醇/水擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的乙醇/水。 用毕复原：先将电压调节旋钮复原，关闭主开关，切断电源。,显微镜保养和使用中的注意事项,不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。 观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 光强要适中，太亮不仅损伤灯泡寿命，也对眼睛有一定的伤害，并且无法进行图像采集。 观察时，两眼睁开，养成能够用两眼观察的习惯，使两眼同时聚焦。 观察临时制片时，不要让玻片中的水分流到载物台上，更不能使酸、碱及其它化学药品与显微镜接触。,染色剂和染色原理,微生物染色常用染料如下表：,实验内容 （简单染色的方法和步骤）,涂片,自然干燥,微火固定,染色l min,冲洗,吸干,镜检,实验内容 （革兰氏染色的方法和步骤）,实验内容 （了解抗酸染色的方法和步骤）,1制片 将少量草分枝杆菌制成菌悬液，80恒温水浴3h杀死菌体。取菌悬液涂片，自然干燥。 2染色 滴加石炭酸复红染液2滴，覆盖涂片，在微火上加热至有蒸气出现，不断补充染液，加热810min，弃染液。 3脱色 用3盐酸乙醇液脱色，至乙醇液呈淡红色或无色。 4水洗 滴加蒸馏水洗去盐酸乙醇。 5复染 加美蓝染液染lmin。 6水洗后自然干燥、镜检 草分枝杆菌呈现红色。若用非抗酸性菌作为对照，则菌体被染成蓝色。,实验内容 （了解芽孢染色的方法和步骤）,孔雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀，制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6的孔雀绿饱和水溶液，间断加热染色10min后(注意添加染液勿使涂片干燥)，用水冲洗。再用0.5蕃红液染色lmin，水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营养体呈现红色。,实验内容 （了解荚膜染色的方法和步骤）,1制片 加一滴6葡萄糖水溶液于载片一端，挑取少量胶质芽孢杆菌与其混合，再加一滴黑色素充分混匀。用推片法制片，将菌液铺成薄层，自然干燥。 2固定 滴加l2滴无水乙醇覆盖涂片，固定lmin，自然干燥。 3染色，冲洗 滴加结晶紫，染色2min，用水轻轻冲洗，干燥后镜检。 有荚膜的菌、菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。无荚膜的菌，由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能出现一圈狭窄的不着色环，但这不是荚膜，荚膜不着色的部分宽。,实验内容 （了解鞭毛染色的方法和步骤）,1载片的清洗：将载片洗净浸泡在95乙醇中备用。 2实验菌种的准备：将枯草芽孢杆菌在新制备的肉膏蛋白胨斜面培养基上(斜面下部要有少量冷凝水)，连续移种34次，每次培养1218h，最后一次培养1216h。 3制片：擦干载片，在载片一端加一滴蒸馏水，用接种环挑取少许菌苔底部有水部分的菌体(注意不要挑出培养基)，将接种环悬放在水滴中片刻，将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓缓流到另一端，可再返转一次使菌液流经面积扩大，然后放平，自然干燥。 4染色（利夫森氏染色法） ：用蜡笔将涂菌区圈起，滴加染液，过数分钟后，当染液的1/2以上区域表面出现金属光泽膜时，用水轻轻将金属膜及染液冲洗干净，自然干燥。 镜检镜检时应在涂片上按顺序进行观察，经常是在部分涂片区的菌体染出鞭毛，菌体及鞭毛均为红色。,实验材料 ,(一)菌种 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。 (二)染液 简单染色：草酸铵结晶紫染液。 革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95乙醇、蕃红染液。,实验材料 ,(三)标本 细菌三型、四联球菌、荚膜、芽孢。 (四)其他物品 无菌水、显微镜、载片、盖玻片、酒精灯、吸水纸、香柏油、擦镜纸、接种环。 肉膏蛋白胨培养基平板。,实验内容,(一) 成片观察 (1)观察细菌三型涂片，比较球菌、杆菌和螺旋菌的形态。 (2)观察四联球菌的形态及排列方式。 (3)观察苏云金芽孢杆菌的芽孢，褐球固氮菌的荚膜的形态。,实验内容,(二)观察平板上的细菌菌落，识别大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征。 注意菌落的形状、高度、大小、颜色，是否湿润、光泽、透明度、边缘状况等等。,实验内容,(三) 革兰氏染色法：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（必做），枯草芽孢杆菌（选做） (四) 环境微生物检查，使用肉膏蛋白胨培养基检查环境中无处不在的微生物。,实验报告内容,(一)画表描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌菌落特征。 (二)绘图：画出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的细胞形态图。 (三)记录革兰氏染色结果；分辨出革兰氏阳性菌或阴性菌。如果染色结果不理想，请分析原因。,思考题,(1)为什