《AKP活性检测20日》PPT课件.ppt

Q&A 关于噬菌体污染,处理： 1、环境用漂白粉灭菌； 2、用消毒液浸泡相关器具； 3、菌种室甲醛熏消一夜；4、福尔马林溶液浸泡； 5、更换或交替使用发酵剂；6、采用抗性菌株；,特征： 1、培养液变澄清； 2、养份没有被正常消耗； 3、噬菌斑：菌液涂板后出现溶菌透明圈，即噬菌斑；,污染原因：菌体自带噬菌体 (特别是溶源性细菌); 环境中存在；,表达产物AKP蛋白的检测,基因的克隆与表达专题之八,AKP,大肠杆菌碱性磷酸酶 (大肠杆菌碱性磷酸酯酶，EC.3.1.3.1) 在碱性环境下: 水解多种磷酸单酯化合物 需要镁和锰离子为激活剂,关于AKP (E.coli alkaline phosphatase）,AKP的理化性质,蛋白检测指标,1、质,活 性,分子量,定 性,结 构,2、量,表达产率,获得产量,蛋白浓度,纯 度,根据蛋白的特性,Western，测序等,电泳，分子筛，沉降系数等,光/色谱，晶体衍射等,分光， 凯氏定氮等,电泳，沉降、晶体衍射等,1、酶活测定：底物显色法,比尔-朗伯定律：OD = LC pNP=17500L mol-1 cm-1 C:光吸收物质的浓度（molL-1） L:光路长度（cm）,1、酶活测定：底物显色法,（其中n为稀释倍数）,酶活力单位数,注:通过调整稀释倍数控制OD410在0.10.8之间,30反应10min,加入3.6ml终止液终止反应,于410nm处测定吸光值,实验操作,1. 菌体加入15mL匀浆液 2. 超声破碎： 输出功率1200w，超声2秒， 间隔10秒，超声次数：40次 3. 粗匀浆制样： 细胞破碎液 200uL 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL 90变性5min，室温保存准备SDS电泳用。 取1ml粗匀浆置于冰上，准备测活 4. 匀浆上清制备： 另取1.0 mL细胞破碎液，4, 12000rpm10min离心，留上清液 5. 上清液制样： 匀浆上清 200uL 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL ， 90变性5min，室温保存准备SDS电泳用。 余下的上清置于冰上，准备测活,一、细胞破碎与制样,二、AKP酶活性分析,谢谢！,丙烯酰胺 甲叉丙烯酰胺,TEMED (加速剂),APS (过硫酸铵,催化剂),聚丙烯 酰胺凝胶,2、分子量测定：SDS-PAG电泳,T：丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的总浓度 -改变T值改变胶孔径,C：表示交联剂所占百分比,SDS-PAGE 的 浓 缩 效 应,电泳体系为不连续体系 电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同 凝胶也由PH、凝胶孔径均不相同的两层胶组成 Cl的快速泳动在其后面形成低电导，高电压梯度区带动Pr和Gly快速泳动，这样在高电压与低电压区形成界面，Pr浓缩成狭小薄层 电荷效应、凝胶的分子筛效应,SDS-PAGE的变性作用,SDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键 巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT)的作用使蛋白质分子中的二硫键打开 二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDS形成蛋白质SDS复合物 由于SDS带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷 SDS与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似于长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比 SDS-PAGE中，SDS蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关,实验操作,1. 洗净胶板，架好和固定好胶板 2. 配置12%分离胶（20mL） 3. 分离胶混匀后用5mL枪头加入两玻 璃夹缝中，并小心在胶面上加入 1cm蒸馏水，约2040min后胶自然凝聚 4. 倾斜倒出蒸馏水，配制5%浓缩胶（10mL） 5. 浓缩胶混匀后加入两玻璃夹缝 6. 在两玻璃板夹缝中垂直插入1.5mm的梳子，浓缩胶凝固后将凝胶装 入电泳槽，在槽中加入1SDS电极缓冲溶液，小心拔出梳子,三、 AKP的SDSPAGE电泳,7. 电泳加样： 将样品12,000r/min 室温离心10min后， 按顺序向胶孔中加入适当体积的蛋白样品（2030uL）和标准样品（10uL） 8. 电泳：接通电源，电压设定为80V开始电泳，当样品进入分离胶时，调节电压使其恒定在120V,当溴酚蓝移动到离底部时，切断电源，停止电泳 9. 将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下凝胶，将凝胶切成两部分 10. 含蛋白标准的凝胶部分用R250染色、脱色和观察结果,谢谢！,3、蛋白定性：Western Blotting,P1:凝胶电泳 P2:转膜(印记） P3:封闭 P4:结合一抗 P5:结合酶标二抗 P6:显色,半干式转移装置,滤纸,实验操作,1. 另一部分凝胶、滤纸和硝酸纤维素膜分别在转移缓冲液中浸泡至少30分钟 2. 正极上铺三层和凝胶一样大小的滤纸，然后依次将硝酸纤维素（NC）膜和凝胶铺在滤纸上，再在凝胶上铺三层滤纸，吸干“三明治”样结构周围的印迹缓冲液，并压另一极上（注意不要有气泡） 3. 恒流1.0mA/cm2，电转移1.5hr 4. 转移结束后将NC膜取出，用保鲜膜封好，40C存放，凝胶继续用R250染色以便分析转移的完全程度,四、免疫分析,5. 到去封闭液，加入1xPBS稀释的一抗（稀释的倍数为ELISA所测效价的1/10），加入的一抗工作液覆盖住膜即可。370C轻轻摇动，孵育45min 6. 1