《从DNA到RNA的过程》PPT课件.ppt

第三章 从DNA到RNA,本章将介绍生物信息的 传递的上半部分，即转录 从DNA到RNA。,基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生理学功能以蛋白质形式得到表达。 DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成mRNA，翻译生成蛋白质的过程控制所有生命现象。,转录（transcription）生物体以DNA为模板合成RNA的过程。 转录后得到的RNA要经过加工才能变成成熟的mRNA 转录产物还可以变为rRNA和tRNA。 参 与 转 录 的 物 质： 底物 : 4种NTP ( ATP, UTP, GTP, CTP ) 模板 : DNA 酶 : RNA聚合酶 其他蛋白质因子,Flash 1-06,一、RNA转录的基本过程,无论在原核还是真核细胞中，RNA链的合成都 具有以下几个特点： RNA按53方向合成 以DNA双链中的反义链为模板 不需要引物参与 合成的RNA有与DNA编码链相同的序列（A-U） 转录的基本过程包括：模板的识别，转录起始， 转录延伸，转录终止,A. 模板的识别 模板的识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链 相互作用并与之相结合的过程。 启动子是基因转录起始所必需的一段DNA序列，是基 因表达调控的上游顺式作用元件之一。 真核细胞中的模板识别与原核细胞有所不同，需要一 些转录调控因子（辅助蛋白），RNA聚合酶才能识别 启动子并形成转录前起始复合物（PIC）。,B. 转录起始 RNA聚合酶结合到启动子上以后，使启动子附近的DNA解旋并解链，形成转录泡以促使核糖核苷酸与模板DNA配对。 转录起始即是RNA链上第一个核苷酸键的产生。 无需引物。 起始后直到形成9个核苷酸的过程是通过启动子阶段，此时RNA聚合酶一直在启动子处，之后进入正常延伸。,C. 转录延伸 转录延伸即是RNA聚合酶释放因子离开启动子后，核心酶沿着模板DNA移动并使新生RNA链不断伸长的过程。 D. 转录终止 当RNA链延伸到终止位点时，RNA将停止合成，转录泡瓦解，DNA链复原，新生RNA链和RNA聚合酶将被释放下来。这即是转录终止。,二、转录系统的组成,A. RNA聚合酶 RNA聚合酶是转录过程中最关键的酶。 原核和真核生物的RNA聚合酶虽然都能催 化RNA的合成，但在其分子组成、种类和 生物化学特性上各有特色。,原核生物RNA聚合酶 在细菌中，一种RNA聚合酶 几乎负责所有mRNA、rRNA和tRNA的合成。 大肠杆菌RNA聚合酶： 2个亚基 1个亚基 1个亚基 1个亚基,核心酶,全酶,转录的起始过程需要全酶，延伸过程仅需要核心酶。 各亚基的功能： 亚基和亚基组成了聚合酶的催化中心，它们 在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基同源。 亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相 结合。 亚基可能与核心酶的组装及启动子的识别有关， 并参与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用。,因子的作用是负责模板链的选择与转录的起始，它是酶的别构效应物，使酶专一性识别启动子。 提高酶对启动子的亲和力，酶底结合常数提高103倍 降低酶对非专一性位点的亲和力，非特异性结合常数降低104倍 某些细菌内含有能识别不同启动子的因子。,单个核苷酸与开链启动子-酶复合物结合 新生RNA的5端 6-9个核苷酸后，稳定酶-DNA-RNA三元复合物 释放因子，进入延伸期,真核生物RNA聚合酶,在真核生物中共有3类RNA聚合酶。 真核生物RNA聚合酶一般由8-16个亚基所组成，相对 分子质量超过5105 。,酵母的RNA聚合酶有12个亚基，晶体结构已定位了聚合酶的10个亚基，催化亚基位于两个大亚基间的缝中，当DNA进入聚合酶时下游的钳子（jaws）结构可夹住DNA链。,双环八肽-鹅膏蕈碱： 在不论何种真核细胞中，RNA聚合酶的活性均可被低浓度的-鹅膏蕈碱所迅速抑制，而聚合酶却不被抑制。聚合酶对-鹅膏蕈碱的反应则不尽相同:在动物细胞中聚合酶可被高浓度-鹅膏蕈碱所抑制，而在酵母和昆虫细胞中则不会被抑制。,其它RNA聚合酶 除了前述两种RNA聚合酶，还有： T3和T7噬菌体RNA聚合酶。仅有一条多肽链组成， 相对分子质量小于1105。 线粒体RNA聚合酶。仅有一条多肽链组成，相对分 子质量小于7104，与T7噬菌体RNA聚合酶有同源性。 叶绿体RNA聚合酶。结构比较大，与细菌RNA聚合酶 相似，由多个亚基组成。,B. 转录复合物 在转录的不同阶段，RNA聚合酶将同DNA结合，形成不同的复合物： 在识别阶段，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭二元复合物。 接着，结合处DNA双链解开，封闭复合物变为开放二元复合物。 转录开始，由RNA聚合酶、DNA和新生RNA形成三元复合物。,除RNA聚合酶外，真核生物转录还需要至少 7种辅助因子参与。这些蛋白辅助因子统 称转录因子。 一般情况下，三元复合物进入以下两条途径： 合成并释放2-9nt的短RNA转录物，即流产式 转录。 尽快释放亚基，转录起始复合物通过启动 子区域形成转录延伸复合物。,某些转录因子能与RNA聚合酶结合形成起始复合物，但不组成游离聚合酶的成分。 这些因子可能是所有启动子起始转录所必须的，但亦可能仅是譬如说转录终止所必须的。 在这一类因子中，要严格区分开哪些是RNA聚合酶的亚基，哪些仅是辅助因子，是很困难的。,全酶：启动子的选择、转录的起始 核心酶：链的延伸 因子帮助转录起始，之后会脱离起始复合物 核心酶合成RNA，但不能识别起始位点,三、启动子与转录起始,A. 启动子区的基本结构 启动子是一段位于结构基因5端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，并具有转录起始的特异性。,原核生物中经对启动子的比较， 它们有共有序列： 在上游10bp处为TATAAT，又称为Pribnow盒 在上游35bp处为TTGACA。,真核生物中： TATA序列(TATA box)：位于-25-35，使转录精确地起始，TATA序列也叫核心启动元件。 CCAAT序列(CAAT box) ：位于-70-80，CAAT区主要控制转录起始频率。 GCCACACCC或GGGCGGG序列（GC box）：位于-110 -80，主要控制转录起始频率。 并非每个基因中都包含这3个区域。,B. 启动子区的识别 RNA聚合酶并不直接识别碱基对本身，而是通过氢键互补的方式加以识别。 在启动子区DNA双螺旋结构中，存在特定方位的氢键供体和受体（碱基上的基团），能与酶分子内也处于特定空间构象的氢键受体与供体结合，从而相互识别。,C、RNA聚合酶与启动子区的结合 在识别阶段，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭二元复合物。接着，结合处DNA双链解开，封闭复合物变为开放二元复合物。,D、-10区与-35区的最佳距离 原核生物中， -10区与-35区之间的距离大约是1619bp，小于15bp或大于19bp都会降低启动子的活性。 细菌中常见的两种突变： 下降突变：如果Pribnow区从TATAAT变为AATAAT就会大大降低其结构基因的转录水平。 上升突变：即增加Pribnow区共同序列的同一性。,E、增强子及其功能 增强子是长约100200bp的序列，它们与启动子不同，可以位于转录起始位点的上游，也可位于其下游。 增强子具有增加启动子的作用，与启动子一起都可视为基因表达调控中的顺式作用元件，可与转录因子和 RNA聚合酶结合，启动并调节基因转录。,增强子的特点： 远距离效应。一般位于上游-200bp处。 无方向性。可位于靶基因的上游、下游或内部。 顺式调节。只调节位于同一染色体上的靶基因。 无物种和基因特异性。可连接到异源基因上发挥作用。 有组织特异性。需要特定的蛋白因子参与。 有相位性。其作用与DNA的构象有关。 有的增强子可以对外部信号产生反应。,F. 真核生物启动子对转录的影响,TATA区：使转录精确的起始 剔除或突变该区，RNA产物起始点不固定,GAAT区和GC区：控制转录起始频率， 不参与起始位点的确定。 该区任意碱基的改变，极大影响靶基因的 转录强度。,G. 转录的抑制 转录抑制剂根据其作用性质主要可以分为两大类： DNA模板功能抑制剂，与DNA结合而改变模板的功能。 RNA聚合酶抑制剂，与RNA聚合酶结合而抑制其活力。 除上述抑制剂外，还有一些嘌呤和嘧啶的类似物，如5-氟尿嘧啶等，可以作为核苷酸代谢拮抗物来抑制核酸前体的合成。,Flash 12-02 12-06,四、 mRNA的特征,A.原核生物mRNA的特征 原核生物mRNA半衰期短 许多原核生物mRNA可能以多顺反子的形式存在 5端无帽子结构，3端没有或只有较短的poly(A)结构 起始密码子常为AUG，有时也为GUG，甚至UUG,存在SD序列(Shine-Dalgarno sequence)。原核生物起始密码子AUG上游712个核苷酸处的一段保守序列，与16S rRNA端3端反向互补，被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用。,B. 真核核生物mRNA的特征： 单顺反子 5端存在帽子结构。 3端具poly(A)尾巴（除组蛋白基因外） 起始密码子仅为AUG,5端加帽反应在转录早期即已完成。帽子结构有三种不同甲基化形式。 帽子的作用可能使mRNA免遭核酸酶的破坏。 甲基化的帽子也可能是蛋白质合成起始信号的一部分。,多聚尾巴是在转录后，由内切酶切开mRNA3端的特 定部位，然后由poly A 聚合酶催化多聚腺苷酸反应。 Poly A是mRNA进入胞质必需的形式，增强稳定性。 mRNA刚进入进入胞质时，poly A尾巴较长，随时间推移将变短直至消失，随后mRNA将降解。,五、终止和抗终止,至目前为止，尚未发现某一特定位点具有特异的转录终止功能。 RNA终止时，3端核苷酸如何定位？ 根据转录终止是否需要辅助因子，可将终止子分为两类： 不依赖于因子的终止 依赖于因子的终止,A. 不依赖于因子的终止 此类终止反应中，无任何其它因子参与。 模板中存在终止转录的特殊信号终止子，又称内在终止子（intrinsic termation） 每个基因或操纵子都有一个启动子和一个终止子。,内在终止子的特点： 终止位点上游一般存在一段富含GC碱基的二重对称区，其转录生成的mRNA容易互补形成的发卡式结构。 终止位点上游一般有48个A组成的序列，转录生成的mRNA的3末端中相应的有一连串U序列。,新生RNA中出现发卡结构可导致RNA聚合酶暂停，破坏RNA-DNA杂合链5端正常结构，寡聚U是杂合链3端部分出现不稳定rUdA区域。新生RNA链将解离出来。 终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关。,B.依赖于因子的终止 有些终止点的DNA序列缺乏共性，不能诱导转录的自发终止，需要因子的参与。 “穷追”模型 大肠杆菌-依赖型终止子占所有终止子的一半左右。,由于不同生理要求，转录过程中有时即使遇到终止信号，仍需要继续转录的现象。,C、抗终止,两种类型： 破坏终止位点RNA的茎-环结构 当介质中某一氨基酸的浓度较低时，缺乏相应氨酰-tRNA，将致使核糖体滞留在串联密码子上，mRNA不能形成特定的二级结构，末端茎-环结构被破坏，因此转录仍将继续进行，出现抗终止现象。,依赖于蛋白质因子的转录抗终止 蛋白复合物形成后，将会改变聚合酶的构象， 使之对终止信号不敏感，从而抗终止。,六、mRNA的加工,hnRNA 和 snRNA 核不均一RNA (heterogeneous nuclear RNA, hnRNA)：核内的初级mRNA snRNA (small nuclear RNA)：核内小分子RNA 小分子核糖核酸蛋白体（small nuclear ribonucleoprotein,snRNP）：也称并接体 （splicesome）,由snRNA和核内蛋白质组 成，作为RNA剪接的场所。 断裂基因(splite gene)：真核生物结构基因， 由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又 连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可 翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这 些基因称为断裂基因。,外显子（exon）和内含子(intron) 外显子：在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。 内含子：隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,真核生物的结构基因中具有可表达活性的外显子，也含有无表达活性的内含子,转录产生的RNA要经过剪接、编辑、再编码及化学修饰等加工过程才能变成有活性的RNA分子。,转录作用产生出的 mRNA、tRNA及rRNA的初级转录本全是前体RNA或核不均一RNA(hn RNA)，而不是成熟的RNA，它们没有生物学活性，还要在酶的作用下，进行加工才能变为成熟的、有活性的RNA。 RNA的加工过程主要是在细胞核内进行，也有少数反应是在胞质中进行。,A. RNA中的内含子 真核生物的基因往往是断裂的基因，其转录所形成的RNA前体要经过剪切，将内含子切除后，将外显子拼接起来才能形成成熟的mRNA。 真核基因平均含810个内含子，前体分子一般比成熟mRNA大410倍。,内含子两端边界存在共有序列：（GU-AG法则） 在内含子内部部分序列也可能参与内含子的剪接，他们可能是pre-mRNA剪接过程中各种核糖核蛋白剪接调节因子的结合位点。,B. mRNA的剪接 许多相对分子质 量较小的核内RNA （如U1，U2，U3， U4，U5和U6）以及 与这些RNA相结合 的核蛋白参与RNA 的剪接。,生物体内各种内含子： 与mRNA前体中主要（GU-AG类）和次要（AU-AC类）内含子剪接方式不同，I、II类内含子能进行自我剪接。,I类内含子的自我剪接过程,Flash 12-22,II类内含子的自我剪接过程,酵母线粒体某些mRNA或rRNA前体中的内含子中一个腺苷酸上的2-OH，进攻内含子的5剪接点并生成2,5-磷酸二酯键，形成一个与3外显子尚未脱离的“套索”式中间产物，同时5外显子被剪下。 脱落的5外显子中的3-OH攻击内含子的3端剪接点，剪下的3外显子并与5外显子连接成成熟的mRNA或rRNA，内含子则以套索形式被剪切下来而被核酸酶降解。,mRNA前体的内含子末端的序列剪接位点突变引起剪 切错误。 剪切位点突变导致地中海贫血症（thalassemia)， 地中海贫血症起因于血红蛋白合成缺陷。此类 贫血症中有一类是异常剪接引起。 -珠蛋白的第一内含子发生突变，突变位点发生在 正常3剪接位点上游20nt处。,正常人是G，病人是A，即GA。导致产生了一个新的3剪接位点（原位点上游），新剪切位点剪切，使mRNA中密码子变化。在新剪切点后提前出现蛋白质合成的终止密码子。结果合成了异常的血红蛋白-亚基，导致贫血症。,C. RNA的编辑、再编码及化学修饰 RNA的编辑 RNA的编辑是某些RNA，特别是mRNA前体的一种加工方式，如插入、删除或取代一些核苷酸残基，导致DNA编码的遗传信息的改变。 介导RNA编辑的机制有两种： 位点特异性脱氨基作用 引导RNA指导的尿嘧啶插入或删除。,位点特异性脱氨基作用 载脂蛋白CU导致提前 终止 由脱氨基酶催化,引导RNA指导的尿嘧啶插入或删除,RNA的编辑的生物学意义： 校正作用 有些基因在突变过程中丢失的遗传信息可能通过RNA编辑修复。 调控翻译 通过编辑可以构建和去除起始或终止密码子，是基