pcr研究方法3 ppt课件

PCR技术,实验3：常见DNA操作技术,内容提要:,一、PCR技术原理,二、耐热DNA聚合酶,三、PCR引物及设计原则,四、PCR条件的优化,五、PCR改进技术,Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法.,很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖， Mullis是其中之一,Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ,聚合酶链式反应(PCR) :,一、PCR技术原理,DNA复制,半保留复制,半不连续复制,冈崎片段,领头链,随从链,引物的化学本质是什么？,单链寡核苷酸DNA或RNA片段。,DNA复制引物：单链RNA片段,PCR引物： 单链DNA片段,PCR原理,PCR (Polymerase Chain Reaction):聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 其基本原理是依据DNA半保留复制以及DNA变性和复性原理，通过控制反应温度，耐高温的DNA聚合酶以单链DNA为模板，以dNTP为原料，使引物沿单链模板延伸合成双链DNA。 高温变性，低温退火，适温延伸三个步骤，使目的DNA片段得以迅速扩增。,（一）PCR基本过程,1. PCR循环由三步组成：,变性（denaturation）,退火（annealing）,延伸（extension）,PCR技术原理,双链DNA,解链为单链DNA,PCR技术原理,双链DNA,解链为单链DNA,引物与单链DNA结合,PCR技术原理,双链DNA,解链为单链DNA,引物与单链DNA结合,72延伸在DNA聚合酶作用下，沿模板链5 3合成互补链,PCR技术原理,双链DNA,解链为单链DNA,引物与单链DNA结合,72延伸在DNA聚合酶作用下，沿模板链5 3合成互补链,PCR技术原理,双链DNA,解链为单链DNA,引物与单链DNA结合,72延伸在DNA聚合酶作用下，沿模板链5 3合成互补链,进入第二个PCR循环,PCR技术原理,双链DNA,解链为单链DNA,引物与单链DNA结合,72延伸在DNA聚合酶作用下，沿模板链5 3合成互补链,进入第二个PCR循环,经过3035个PCR循环，目的DNA片段增加23035,PCR原理,低温退火,高温变性,中温延伸,在模板DNA、引物、4种dNTP存在条件下，依赖DNA 聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。,2. PCR定义：,3. PCR扩增终产物大小:,介于两条退火引物5末端之间的双链DNA片段。,4.什么叫引物延伸产物？,比两引物限定区长的延伸产物。仅发生在以原始模板DNA为模板的扩增过程中，以倍数形式扩增(2n)。,Y=A（1+E）n Y: 扩增产物的量 A: 最初靶DNA分子数 E: PCR扩增效率 n: 循环次数,5. PCR产量,当E100, A=1时 Y=2n 2n(引物延伸产物的量）,PCR 循 环 数 与 DNA 产 量,（二）平台期与平台效应,1. 平台效应（plateau effect）： PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入静止期即平台期。,PCR平台效应,二、耐热DNA聚合酶,（三）高保真的耐热DNA聚合酶,（二）Taq DNA聚合酶,（一）PCR耐热DNA聚合酶的发现,（一） PCR耐热DNA聚合酶的发现,2.T4 与T7 DNA聚合酶:热稳定性差。,1. 大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段 ： 热稳定性差，不耐高温。 反应温度偏低，产生非特异扩增。,3.Taq DNA聚合酶:实现了PCR自动化,（二）Taq DNA聚合酶,从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分离出来。,基因全长:2,496 bp 编码蛋白质: 832个AA, 94 kd,C端结构域: 53外切酶活性 N端结构域: 聚合酶活性,1.较高的热稳定性, 95的半衰期: 40 min 最适温度: 72 80 催化反应速率: 150300核苷酸 / 秒/ 酶分子,Taq DNA聚合酶特性：, 53聚合酶活性； 53外切酶活性； 逆转录酶活性； 较弱的非模板依赖性； 缺乏35外切酶活性。,2. 无机离子及抑制剂,Taq DNA聚合酶的活性对Mg 2+ 浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。,最适Mg 2+浓度：2 mmol/L K+浓度：50 mmol/L,3. 保真性,如何提高PCR DNA聚合酶的保真性？, 使用Taq DNA聚合酶时，掺入少量具有35外切酶活性的耐热DNA聚合酶,错配率可降为原来的1/10； 使四种dNTP底物浓度相等； MgCl2浓度尽可能低； 减少循环数。,（三）几种高保真的耐热DNA聚合酶,1. Tth DNA聚合酶 2. Vent DNA聚合酶 3. Pfu DNA聚合酶,三、PCR引物及设计原则,（一）引物设计原则,（二）引物用量计算,（一）引物设计原则,引物序列及其与模板特异性结合是决定PCR反应结果的关键。,1.引物设计原则:, 引物长度: 1030 Nt, 碱基分布: A、T、G、C 随机分布, G+C含量：40 60% Tm=4(G+C)+2(A+T), 引物之间：避免3端互补, 引物自身：不应形成二级结构,引物5末端碱基:可不与模板 DNA互补, 引物3末端碱基：最好选T、 C、 G，不选A,简并引物设计及应用：, 对纯化的未知蛋白测定一段短 氨基酸序列。 不同物种某一基因编码的保守 氨基酸区域。,应用：基于简并引物PCR策略克隆 新基因,3.引物设计缺陷而引起的后果,4.优化的引物设计实例,上游引物序列： 5GAGAACATGGTGCGCAGGTT 3 下游引物序列： 5TGCCCATCATCATGACCTGG 3,5 CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG GGTCCAGTACTACTACCCGT AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCGGAGCCCAACTGCGCCGACCCC 3,1 A260 oligo DNA33g N: 引物碱基数 X：合成的oligo DNA A260单位 Y：引物的pmol数,106 Y（pmol）= X33 330 . N X = 105 N,(二) 引物用量计算,四、PCR条件的优化,(一) Taq DNA聚合酶浓度： 1.02.5 U/100 l反应液,(二) dNTP浓度：20200mol/L,(三) Mg2+浓度：0.52.5 mmol/L,(四) 引物浓度：0.10.5 mol/L,PCR应用举例,遗传病诊断：镰状细胞贫血 6 Glu Val (GAG GUG) PCR扩增6 DNA区域 传染病诊断：HBV和HIV 肿瘤分子标志诊断: bcr-abl PML/RAR 个体识别: 亲子鉴定与刑事侦破 生物考古,五、PCR改进技术,（一）RT-PCR (reverse transcription PCR),以mRNA为模板逆转录合成cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应。,RT-PCR原理,逆转录酶, AMV（avian myeloblastosis virus） 酶活性最适温度42 , MMLV（Moloney murine leukemia virus）：最适温度37 ,实验室常用PCR仪,PCR反应基本要素,PCR反应五要素: 引物 酶 dNTP 模板 Mg2+,DNA模板 引物 反应缓冲液 dNTP ddH2O 耐热聚合酶 Mg2+,PCR反应基本条件,反应体系对PCR扩增的影响,DNA模板,纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 加量过多导致非特异性扩增增加 特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体 完整性 避免反复冻融 浓度 应适当,过高导致非特异性增加,过低则,引 物,扩增产物太少,反应体系对PCR扩增的影响,反应Buffer,pH值,盐离子浓度 稳定剂,增强剂,Mg 2浓度,过高非特异性严重 过低无扩增产物,dNTP Mixture,浓度适当 避免反复冻融,ddH2O,pH值适当 避免污染,模板核酸,PCR反应中模板加入一般为102105拷贝的靶序列。 扩增不同拷贝数的靶序列时，加入的含靶序列的DNA量亦不同。 如真核rRNA基因有200500拷贝，反应中仅需加入0.52ng人基因组DNA即可。,引 物,引物是PCR特异性反应的关键。 PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。 理论上，只要知道任何一DNA模板序列，就能设计互补的寡核苷酸链做引物。 利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。,设计引物应遵循以下原则：,引物长度：1530bp,常用为2027 bp左右。 引物扩增跨度：以200500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 引物碱基G+C含量：以4060%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3端互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。,引物3端的碱基：特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 引物中能加上合适的酶切位点：被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。,设计引物应遵循以下原则：,dNTP,PCR反应液中，dNTP的使用浓度通常为20-200mol/L，在此浓度范围内，PCR产量、特异性与合成忠实性间的平衡最佳。 高浓度的dNTP易产生错误掺入 浓度太低势必降低反应产物的产量 最低的适宜dNTP浓度可根据特定靶序列长度和碱基组成来确定。,四种dNTPs的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时，就会诱发聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止延伸反应。 dNTP的pH高低也很重要，应调至pH8.3-8.6使用。 通常把dNTP配成5-10mmol/L贮存液，用NaOH调至pH至中性，分装后-20冻存。,dNTP,dNTP的质量与浓度,dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。 dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度，并以1M NaOH或1M TrisHCL的缓冲液将其pH调节到7.07.5,小量分装, 20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。 dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。,TaqDNA聚合酶,从水生栖热菌YT1株分离纯化而来的。 该菌株于1969年从美国国家公园的温泉中分离，可以在70-75的环境中生长。 该酶全基因长2496bp，编码832个氨基酸，分子量为64KDa。 目前已可通过基因工程来生产，是PCR最常使用的耐热DNA聚合酶。,TaqDNA聚合酶热稳定性,TaqDNA聚合酶最适的工作温度为75-80，此时的延伸速率为每秒150个核苷酸，温度降低时延伸速率也随之降低，70的延伸速率为每秒60个核苷酸，55为每秒24个，37时为每秒1.5个，20时为每秒0.25个。 温度太高时，合成速率急剧下降。90以上时几乎无DNA合成，但此时的热稳定性仍较好，在92.5, 95和97.5分别经过130min，40min和9min，仍能保持50%的活性。,Taq DNA聚合酶,在其它参数最佳时，Taq DNA聚合酶用量为1-2.5U/100l时效果最佳。 Taq DNA聚合酶用量过多不但造成浪费，还可使非特异产物增加，靶序列扩增产物降低；过低时，则靶序列产量很低。 。 酶的最适用量可根据不同的模板分子或引物而变化。最好在100l反应体积中加入0.5-5U酶试验最佳酶浓度。,PCR反应后可通过下述方式之一灭活Taq DNA聚合酶： (1)99-100加热10min； (2)加入EDTA-Na + 至10mmol/L螯合Mg2+； (3)酚-氯仿抽提，乙醇沉淀PCR产物。,Taq DNA聚合酶,Mg 2+,Mg2+ 是Taq DNA聚合酶活性所必需的，也影响着引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的形成等。 Mg2+ 最佳作用浓度相当低，在各种单核苷酸浓度为200mol/U时， Mg2+浓度为1.5mmol/U时较合适。 浓度过低，PCR产物量减少。 Mg2+浓度过高，PCR反应的特异性会降低。,PCR混合物中的DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+浓度，而Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+ 。 引物和模板DNA原液中如含EDTA等螯合剂也会影响游离Mg2+浓度。 PCR中Mg2+的加入量要比dNTP浓度高0.2-2.5m mol/L。 最好对每种模板,每种引物均进行Mg2+浓度的优化。,Mg 2+,扩增反应缓冲液,目前最为常用的缓冲体系是10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8，20)。 反应混合物中50mmol/L以内的KC1有利于引物退火； 50mmol/L NaCl或50mmol/L以上的KCl则会抑制Taq DNA聚合酶活性； 有些反应中以NH4+ 代替K+，其浓度为16.6mmol/L，用于PCR的标准缓冲液中。,扩增反应缓冲液,KCl的浓度为50mmol/L Tris-HC1(pH8.3，于室温为10mmol/L) 小牛血清白蛋白(100g/ml)或明胶(0.01%)或Tween 20(0.05%-0.1%)有助于Taq DNA聚合酶的稳定。 反应液加入5mmol/L DTT也有类似作用，尤其在扩增长片段时，加入这些酶保护剂对PCR反应有益。,PCR,琼脂糖凝胶电泳,最终产物,紫外光观察,3-4 小时,特点：PCR具有极高的灵敏度,样品,正对照,负对照,标准分子量,（二）PCR常见问题、原因分析及其解决方案,PCR常见问题,无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,PCR常见问题之一,无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,原因,对 策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间,现象：正对照有条带，而样品则无；,PCR常见问题之二,非特异性扩增,现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,PCR常见问题之二,引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多,原因,对 策,重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数,非特异性扩增,PCR常见问题之三,拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear状态。,M 1 2,PCR常见问题之三,模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多,原因,对 策,纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数,拖尾,PCR常见问题之四,假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),原因：靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物,对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,（三）提高PCR反应特异性的策略,巢式PCR（Nest-PCR）,四种策略,递减PCR（TouchDown PCR）,热启动PCR（HotStart PCR）,使用PCR增强剂,策略之一,巢式PCR（Nest-PCR）,巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。,巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。,策略之二,递减PCR（TouchDown PCR）,递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。,特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。,递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。,策略之三,热启动PCR （HotStart PCR）,热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度；,现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；,热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。,策略之四,使用PCR增强剂,甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。,其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。,增强剂浓度要适当,从定性到定量的革命,定量PCR,从定性到定量的革命,普通PCR,适用定性分析，不适合定量分析； PCR 产物的长度从100bp 数kb,实时检测:每个循环都产出荧光信号 绝对定量，灵敏度更高 PCR产物的长度一般在 60-150 bp,定量PCR,（二） 定量RT-PCR（QRT-PCR）,PCR扩增指数期内极小的扩增效率改变会极大地影响产量。,1. 半定量RT-PCR,以样本mRNA为模板逆转录合成cDNA，在不同引物对引导下共同PCR扩增“看家”基因和目的基因cDNA 。, 选择内对照基因 组织中普遍表达、表达量比较恒定的“看家”基因mRNA。如GAPDH和 -actin mRNA等。, 半定量标准 计算PCR 产物 ： 靶cDNA /GAPDH cDNA,RT-PCR验证G-Rh2诱导TNFmRNA表达上调, 举例,2. Real-time RT-PCR原理： PCR体系加入一种双色荧光标记的寡核苷酸探针，根据探针上荧光信号的变化，计算模板DNA的含量。,实时PCR应用：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。,定量检测PCR产物的指示系统: TaqMan和Molecular Beacon，均依赖荧光共振能量转移