实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应.ppt

实验四、 植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应,一、实验目的,（一）掌握分光光度法测定过氧化氢酶的方法； （二）重金属对过氧化氢酶的影响及其机理。,酶：由活细胞产生的具催化功能的蛋白质； 酶催化底物发生的生物化学反应（酶促反应）；,与一般催化剂的相同点 反应中质与量不变，用量少、缩短平衡时间，不改变平衡点、只催化特定反应、降低反应活化能。 不同点 高效 （106-1013） 高度专一 对反应和反应物有严格选择性 条件温和（酶易失活） 引起蛋白质变性的因素都能使酶失活,2H2O2 2H2O+ O2,过氧化氢酶(catalase),干旱、重金属等环境胁迫下植物机体内容易产生ROS（Reactive Oxygen Species）如：O2-、H2O2、OH-等，因此激发保护酶体系（过氧化物酶POD、超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶（CAT）清除自由基，提高抗逆性。,几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶，其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞及某些组织内的过氧化体中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不致于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的OH - 。,二、实验原理,Cu2+使植物体内活性氧代谢加强，H2O2积累，使细胞受害，而过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶防御系统之一。植物体内H2O2含量，过氧化氢酶活性与植物抗逆性密切相关。 H2O2在240nm具有强烈吸收峰。,三、实验仪器和用具,（一）实验器材 光照培养箱、白瓷盘、医用纱布、烧杯、移液器、离心机、离心管、电炉、紫外分光光度计、天平、研钵、容量瓶（25ml）、试管、水浴锅。 （二）材料 水稻种子。 （三）试剂 2.0 mM CuSO4、磷酸缓冲液、木村B培养液。,四、实验方法和内容,前处理 浸种催芽 培养（木村B培养液，20培养至2叶1心） 处理（对照和2.0mM CuSO4处理）,1.酶液的提取 称取新鲜水稻叶片0.5g置于研钵中，加入2-3ml 4 预冷的pH 7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中。用缓冲液冲洗研钵数次，并合并冲洗液，定容。 容量瓶于4 冰箱中静置10min，取上清液在4000rpm下离心10min，上清即为粗酶液。,冰箱中静置10 min,4000rpm下离心10min,2.测定 取10 ml试管3支，其中2支为样品管，1支为空白管，按表1加入试剂。,表1 紫外分光光度法测定H2O2样品配置表,对照管：煮沸3-5 min; 样品管25 预热5min,样品管25 预热后，逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4次。对照管在煮沸5min后加入H2O2，并测定。等3支试管测定完后按下式计算酶活性。,数据记录,3.结果计算,式中,AS0加入煮沸酶液的对照管吸光值； AS1， AS2样品管吸光值； VT粗酶提取液总体积（25 ml）； V1测定用粗酶液体积（0.2 ml）； FW样品鲜重； 0.1A240每下降0.1为1个酶活力单位； t从加过氧化氢到最后一次读数的时间（3