《基因克隆原核表达》PPT课件.ppt

基因的克隆与表达 山东大学医学院免疫学研究所 马春红,基因克隆(gene clonging) 基因表达(gene expression) -原核基因表达 -真核基因表达,基 因 克 隆 Gene Cloning,概述 克隆载体 受体细胞 体外重组的策略 基因克隆工作流程,一、概 述,1973年Cohen完成第一个基因工程实验,经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌,所需元件： 限制性内切酶 连接酶 载体 受体细胞,基因克隆（分子克隆molecullar cloning）-通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。,基因克隆的核心-体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。,基因克隆的技术路线 目的基因 载体,体外重组,重组子（杂合DNA）,转化,受体细胞,筛选阳性克隆,大量扩增，获得子代DNA,二、克隆载体,三、受体细胞 1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性,四、体外重组的策略 1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 最方便简单 高背景-载体自身环化 双向插入,2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略 粘-粘连接：最有效、最快捷 粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平,2、平末端连接： 酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA 效率低，酶用量大,3、人工接头连接 人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段,4、T-A克隆 T-vector两条链的5端含有一个游离的T PCR过程中，增加延伸时间，Taq酶可在产物的3端多加一个A,五、基因克隆的工作流程 （一）目的基因的获得 1、直接分离 3、构建cDNA文库 4、PCR 5、人工合成 6、差异显示,1、直接分离DNA适用于克隆原核生物的基因组文库,2、构建基因组文库，筛选目的基因 基因组文库(gene library)：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。,构建流程,抽提基因组DNA,鸟枪法制备DNA片段,DNA片段与载体重组,转化宿主菌,筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）,特点及应用： 包含所有遗传信息 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因） 筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况,3、构建cDNA文库，筛选目的基因 cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。,cDNA文库仅包含正在表达的基因 不同物种、不同组织的cDNA文库不相同 基因总量少，易筛选,4、PCR扩增目的基因片段 适用于克隆序列清楚的基因 以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法,5、人工合成较短的DNA 6、差异显示法(differential display, DD)筛选差异表达的基因,（二）体外重组 连接体系的建立： 温度：粘末端连接：12-18 平末端连接：室温（低于30) DNA量：载体分子数/目的基因分子数=1：1-3 酶量：平端连接时需加大酶量,（三）转化Cacl2法、电击法 （四）重组子的筛选及鉴定 1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑） 原位杂交 2、鉴定： 长度鉴定：酶切、PCR 方向鉴定：联合酶切 测序,原核基因表达系统,一表达系统： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。,据受体细胞的不同可分为： 1原核表达载体系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。,二原核生物基因结构和表达特点,原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。 原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。,多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）：即可作为两个或多个肽链翻译模板的mRNA,3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统,4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。,操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位,原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。 共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。 包括：调控区(调节基因，启动基因， 操作基因)、 结构基因：,5、原核生物中参与转录的基因结构： 启动子 终止子,启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 一般长40-60bp，富含A-T硷基对 共有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区：,RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录 各种启动子启动转录能力不同。 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列,终止子（terminator，T）:位于基因3端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列,富含GC的反向重复序列 富含AT的序列,转录形成发夹式结构,6、与转译有关的原核细胞结构：核糖体结合位点 转译起始密码子AUG SD顺序（shine-dalgarno）： AUG上游3-11 bp 长约3-9bp mRNA与30s核糖体亚基间的识别与结合序列,三外源基因在原核表达系统中表达的必要条件： 删除内含子和5非编码区 外源基因置于强启动子和SD顺序控制下 维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解,四影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素： 1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。,常见原核强启动子： Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导 Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。 Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。 PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受噬菌体CI基因负调控。温度诱导。,2、基因剂量： 3、核糖体结合位点： SD顺序与16srRNA3末端互补程度。 AUGSD间距离。 AUG后的核苷酸,四原核表达载体： 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。 主要元件：强启动子 SD顺序 筛选标志 其它调控基因,类型： 融合型表达载体：-融合蛋白 非融合型表达载体：-天然完整蛋白 分泌型表达载体：-产物可跨膜分泌至胞周间隙,（一）融合型表达载体,P,SD,Foreign DNA,融合型表达载体,融合基因,1、主要元件：强启动子 SD 原核基因3端,2、技术关键：克隆基因插入原核序列近3端而维持正确阅读框架。 选择合适酶切位点： 加人工合成的DNA接头 构建位相载体,-ATG - AAC CTG GAA TTC CTA GGT - -TAC -TTG GAC CTT AAG GAT CCA-,EcoRI,BamHI,AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA,载体部分序列,DNA序列,位相载体-含有3种读码框的系列载体,3、优点： 表达效率高 产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定 易纯化：利用融合原核多肽的特性,Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白直接纯化 产物切割方便： pGEX-1T凝血酶 pGEX-2T-凝血酶 pGEX-3T-X因子 位相载体,融合型载体-pGEX系列,（二）非融合型表达载体,P,SD,Foreign DNA,非融合型表达载体,非融合基因,主要元件：强启动子 SD： ATG：第一个密码子,非融合型表达载体-pPL-Lamda,PL启动子-温度诱导 插入位点-HpaI,（三）分泌型表达载体： 1、主要元件： 启动子和SD序列 信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。,分泌型表达载体-pINIII-ompA1,分泌型融合表达载体-pEZZ18,五提高表达水平的手段 1、选择合适载体 强