中药制剂分析第六章中药制剂中各主要成分的分析医学课件

第六章 中药制剂中各主要成分的分析,第一节 生物碱类 第二节 黄酮类 第三节 三萜皂苷类 第四节 醌类 第五节 挥发油类 第六节 其他成分,第一节 生物碱类,一、结构特征及理化性质 二、定性鉴别 三、含量测定 四、应用举例,一、结构特征及理化性质,（一）结构特征 生物碱大多结构复杂且类型众多，主要有杂环类、萜类、甾类及有机胺类等。结构中氮原子存在形式多种多样，如脂氮、芳氮；季铵、叔胺、仲胺及伯胺；游离状态和与酸结合状态等。此外，结构中常有多种取代基存在，如烃基、羟基、羧基、酯基等。,一、结构特征及理化性质,（二）理化性质 1. 物理性状 多数生物碱为结晶型固体，少数为无定形粉末，个别小分子生物碱为液体，如槟榔碱、烟碱等。液体生物碱及个别小分子生物碱具有挥发性和升华性，如麻黄碱具有挥发性、咖啡因具有升华性等。一般生物碱为无色或白色，结构中存在较长共轭体系时可显不同颜色，如黄连生物碱显黄色。 2. 溶解性 大多数生物碱属亲脂性成分，游离状态下难溶于水，易溶于氯仿、乙醚、丙酮、甲醇、乙醇等有机溶剂；与酸结合成盐后水溶性增加，但与不同酸生成的盐水溶性有差异，一般含氧无机酸及小分子有机酸的生物碱盐水溶性较大。季铵型生物碱、生物碱氮氧化物易溶于水，一些小分子生物碱则既可溶于水也可溶于有机溶剂。含有酸性基团(如酚羟基、羧基)的生物碱可溶于不同碱性的碱水溶液中，含有内酯环、内酰胺结构的生物碱可溶于热苛性碱水溶液。 3. 酸碱性 大多数生物碱具有不同程度的碱性。碱性强弱取决于生物碱结构中氮原子的杂化方式、电子云密度分布以及分子的立体效应、氢键效应等。酰胺类生物碱一般碱性较弱，几呈中性；如果在生物碱结构中尚存在酸性基团，则同时会表现出酸碱两性。,一、结构特征及理化性质,4. 沉淀反应 大多数生物碱在酸性水溶液中可以与生物碱沉淀试剂(如碘化物复盐、重金属盐和大分子酸等)生成不溶于水的复盐或分子复合物，借以检查中药制剂中生物碱的存在和测定中药制剂中生物碱成分的含量。但须注意的是，共存的蛋白质、多肽和鞣质等成分，也可与生物碱沉淀试剂生成沉淀，产生假阳性。因此，用沉淀反应进行中药制剂中生物碱成分分析时，要用适宜的方法先行处理样品供试液，排除干扰。 5. 显色反应 少数生物碱可与特定试剂反应产生不同颜色。生物碱在一定pH条件下可与一些酸性染料定量结合，生成有色络合物，被氯仿等有机溶剂定量提取；具有酯键结构的生物碱，如乌头碱等，可与异羟肟酸铁试剂反应产生紫红色。这些显色反应可用于中药制剂中生物碱成分的分析。 6. 紫外光谱特征 结构中具有共轭体系的生物碱可产生 紫外吸收，如吡啶类、喹啉类、吲哚类生物碱等。吸收峰位置和强度除与助色团的种类、位置、数目有关外，需要特别指出的是，生物碱结构中的氮原子若与发色团直接连接或参与发色团，则还与测定溶剂的pH有关。,二、定性鉴别,（一）理化鉴别 沉淀反应是生物碱理化鉴别常用方法，一般在酸性水溶液中进行，苦味酸试剂和三硝基间苯二酚试剂也可在中性条件下进行。由于中药制剂成分复杂，一些非生物碱成分可能引起假阳性结果，因此，制备样品供试液时必须净化处理，以除去干扰成分，方能用沉淀反应进行中药制剂中生物碱类成分的鉴别。另一方面，少数生物碱不能与生物碱沉淀试剂发生沉淀反应，可能引起假阴性结果，如麻黄碱。,二、定性鉴别,（二）色谱鉴别 1. 薄层色谱法 常用硅胶或氧化铝薄层色谱。制备供试品溶液时，要根据被测成分的特点，如存在状态、溶解性及共存成分的性质等，选用适宜的溶剂和方法进行提取，提取液浓缩后或净化处理后，用有机溶剂溶解，点在薄层板上。展开剂常选择氯仿、苯等低极性溶剂，再根据待检识成分的极性加入其他溶剂调整极性，以达到满意的分离效果。由于硅胶显弱酸性，分离检识生物碱时，易导致色谱斑点Rf值很小、拖尾或形成复斑等，因此在硅胶吸附薄层色谱中，常用碱性系统或在碱性环境下展开。薄层色谱展开后，除少数有色生物碱可直接在可见光下观察，有荧光的生物碱可在紫外灯下观察外，绝大多数生物碱需喷试剂显色。最常用的显色试剂是改良碘化铋钾试剂，喷洒后大多数生物碱显橘红色斑点，有时为了提高显色灵敏度，可在喷碘化铋钾试剂之后，再喷硝酸钠试剂。此外还可选用硫酸铈、碘铂酸等作为显色试剂。个别生物碱的显色试剂特殊，如麻黄碱，一般用茚三酮试剂显色。,二、定性鉴别,2. 纸色谱法 纸色谱法可用于生物碱盐或游离生物碱的鉴别。鉴别生物碱盐时，一般以水为固定相，极性较大的酸性溶剂为展开剂，最常用的是正丁醇-醋酸-水(BAW)系统。如果用一定pH的酸性缓冲液为固定相，则选用极性较小的溶剂系统为展开剂。鉴别游离生物碱时，常用甲酰胺作固定相，以甲酰胺饱和的亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙酸乙酯为展开剂。 3. 高效液相色谱法 高效液相色谱法对结构十分相似的生物碱有良好的分离效果。它具有快速、灵敏、微量等优点。在恒定的高效液相色谱条件下，各种生物碱均有一定的保留时间，可作为定性鉴别的参数。如果条件不完全相同，则用已知对照品作内标物，采用峰面积或峰高加大法进行检识。,三、含量测定,（一）总生物碱含量测定 1. 化学分析法 化学分析法包括容量分析法和重量分析法，测定中药制剂中总生物碱成分含量时，多用于处方药味较少、成分较简单、生物碱含量较高的中药制剂。容量分析法主要使用酸碱滴定法，根据生物碱碱性强弱可选择水溶液或非水溶液的酸碱滴定法。重量分析法根据操作可分为两种，一种是将供试液适当净化后，用适宜的方法(如生物碱酸水液加碱碱化，使生物碱游离，沉淀析出)将生物碱沉淀后直接称重。此法可用于混合碱、未知结构或分子量相差较大的生物碱的含量测定，优点是计算简便，不用换算因数，也不必考虑生物碱的分子量；缺点是挥发性生物碱、对碱不稳定的生物碱不宜用。另一种方法是将供试液适当净化后，加入某些试剂，如加入生物碱沉淀试剂使生物碱生成不溶性沉淀，称量沉淀，计算生物碱的含量。这种方法的优点是取样量少、灵敏度高；缺点是操作繁琐，生成沉淀的影响因素较多，如沉淀试剂、pH、温度等。,三、含量测定,2. 分光光度法 分光光度法用于中药制剂中总生物碱成分的含量测定，可选择待测生物碱成分本身的吸收波长直接测定，也可加入某些试剂如雷氏盐、酸性染料等反应后比色测定。 (1)直接测定 直接测定系指不经过化学反应、利用待测成分自身的紫外吸收直接进行测定的方法。该方法一般用于药味较少、干扰不大的中药制剂中总生物碱的含量测定。(2)离子对萃取比色法 离子对萃取比色法用于中药制剂中微量生物碱类成分的含量测定，其原理是在一定的pH介质中，生物碱与一些酸性染料，或磺酸类、酸类的阴离子，定量地结合为有色离子对(配位物)，此离子对可定量地溶于某些有机溶剂，然后在一定波长下测定有机溶剂的吸收度，或经碱化后释放出的酸性染料等的吸收度，按分,三、含量测定,光光度法计算生物碱的含量。可作为离子对配体的试剂有甲基橙、溴麝香草酚兰和溴甲酚绿等酸性染料；甲苯-4-磺酸和萘-2-磺酸等磺酸类成分；苦味酸、苯甲酸和水杨酸等酚类和羧酸类成分。此外，一些无机离子，如 CI一、Br一、I一和 CIO4等，亦可作为离子对配体。总生物碱含量测定多用酸性染料比色法和苦味酸盐比色法。 酸性染料比色法：在适当的pH介质中，生物碱B可与氢离子H+结合成盐，成为阳离子BH+，而酸性染料在此条件下解离为阴离子In，生物碱盐的阳离子与染料阴离子定量地结合成有色的配合物(离子对)。此离子对可定量地溶于某些有机溶剂，测定有机溶剂的吸收度或经碱化后释放出的染料的吸收度，按分光光度法计算生物碱的含量。,三、含量测定,BH十十In(BH十In)BH十In 应用本法的关键在于介质的pH、酸性染料的种类和有机溶剂的选择，其中尤以pH的选择最为重要。如果pH偏低，虽然可使生物碱以盐的形式存在，但染料仍以酸的形式存在；如果pH偏高，染料以阴离子形式存在，而生物碱却以游离状态存在，两种情况均不能使阴阳离子定量结合。pH的选择要根据染料的性质及生物碱的碱性(pKa)大小来确定。一般生物碱一元碱与溴麝香草酚兰形成1:1的离子对，pH最好在5.26.4之间；二元碱与溴麝香草酚兰形成l:2的离子对，则pH最好在3.05.8之间。常用酸性染料有甲基橙、溴麝香草酚兰、溴甲酚绿、溴酚兰和溴甲酚紫等。选择有机溶剂的原则是根据离子对与有机相能否形成氢键以及形成氢键能力的强弱而定。氯仿、二氯甲烷与离子对形成氢键，有中等程度的提取率，且选择性较好，是常用的提取溶剂。,三、含量测定,苦味酸盐比色法：苦味酸盐比色法是利用在弱酸性或中性溶液中生物碱可与苦味酸定量生成苦味酸盐沉淀，该沉淀可溶于氯仿等有机溶剂，也可以在碱性下解离释放出生物碱和苦味酸，测定有机溶剂的吸收度或经碱化后释放出的苦味酸的吸收度，按分光光度法计算生物碱的含量。具体操作方法可分为三种：其一，滤取生物碱苦味酸盐沉淀，洗去多余试剂，加碱使沉淀解离，以有机溶剂萃取游离出的生物碱，用含有苦味酸的碱性水溶液进行比色测定，再换算出生物碱的含量；其二，在pH7的缓冲溶液中加试剂，使生物碱与苦味酸成盐，用氯仿提取该盐，再用pH11的缓冲溶液使其解离，苦味酸转溶到碱水液中进行比色，再换算出生物碱的含量；其三，直接在pH45的缓冲溶液中加氯仿提取生物碱苦味酸盐，氯仿液在360nm直接比色测定。,三、含量测定,(3)雷氏盐比色法 雷氏盐在酸性介质中可与生物碱类成分定量地生成难溶于水的有色络合物。结构中只含1个碱性氮原子的生物碱，与雷氏盐反应生成的沉淀组成受pH影响较小；含2个或2个以上氮原子的生物碱，与雷氏盐反应生成的沉淀组成与各氮原子碱性强弱和pH有关：氮原子碱性均较强的生物碱，在酸性较小的溶液中生成单盐，在酸性较大的溶液中可相应地生成双盐、叁盐等；氮原子碱性较弱的生物碱，则无论酸性较强还是较弱均生成单盐；季铵碱分子中有几个季铵氮原子，即与几分子雷氏盐结合。 生物碱雷氏盐沉淀易溶于丙酮，其丙酮溶液所呈现的吸收特征是由于分子结构中硫氰酸铬铵部分，而不是结合的生物碱部分，因此，既可以将生物碱雷氏盐沉淀过滤洗净后溶于丙酮(或甲醇)直接比色测定，换算生物碱的含量；也可以精密加入过量雷氏盐试剂，滤除生成的生物碱雷氏盐沉淀，取滤液在520526nm(溶于甲醇时，其max为427nm)比色测定剩余的过量雷氏盐含量，间接计算生物碱的含量。,三、含量测定,硫氰酸铬铵在丙酮中的摩尔吸收系数106.5(单盐)，故可根据其吸收值A按下式直接测定而不需绘制标准曲线。 式中，W：被测物重量(mg)；M：被测物分子量：V：溶解沉淀所用丙酮的毫升数。 雷氏盐比色法测定生物碱含量时，需要注意以下几个问题：雷氏盐的水溶液在室温可分解，故用时应新鲜配制，沉淀也需在低温进行。雷氏盐丙酮(丙酮-水)溶液的吸收值，随时间会发生变化，应尽快测定。,三、含量测定,(4)异羟肟酸铁比色法 含有酯键结构的生物碱，在碱性介质中加热，酯键水解，产生的羧基与羟胺反应生成异羟肟酸，再在酸性条件下，与Fe3+生成紫红色配合物(异羟肟酸铁)，可用比色法进行含量测定。,三、含量测定,（二）单体生物碱含量测定 1. 薄层色谱法 用薄层色谱法测定中药制剂中含有的单体生物碱成分的含量，具有简便、快速的优点。若中药制剂成分复杂，单体生物碱含量较低，应注意样品的净化富集。薄层色谱吸附剂、展开剂及显色方法选择，与前述定性鉴别相似，但要求较为严格。如使用改良碘化铋钾等作为显色剂时，必须完全挥干展开剂(尤其在碱性环境下展开的)后才可喷洒，否则背景深、反差小，影响测定。,三、含量测定,2. 高效液相色谱法 由于生物碱类化合物碱性强弱不同，存在形式不同(游离型或与酸结合成盐)，用高效液相色谱法进行中药制剂中单体生物碱成分的含量测定时，可选择分配色谱法、吸附色谱法以及离子交换色谱法等。在分配色谱法中，既可采用正相色谱也可采用反相色谱，其中以反相高效液相色谱应用较多。常用非极性键合相，如十八烷基键合相(简称ODS或C18)作为固定相，但残存游离硅醇基会影响生物碱色谱行为，使保留时间延长、峰形变宽、拖尾。为了克服游离硅醇基的影响，可在流动相中加入硅醇基抑制剂二乙胺、三乙胺等；也可在流动相中加入低浓度离子对试剂辛烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠(调整合适pH值，偏酸性)，季铵盐试剂(如溴化四甲基铵)或一定浓度的电解质缓冲盐。,三、含量测定,3. 气相色谱法 气相色谱法仅适用于有挥发性的，遇热不分解的单体生物碱的含量测定，如麻黄碱、槟榔碱等。一些游离生物碱及其盐类均可直接进行气相色谱分析，但只能得到一个游离碱的色谱峰，这是由于生物碱盐类在急速加热下，可分解为游离生物碱。生物碱盐在急速加热器中产生的酸对色谱柱和检测器不利，应该注意。,四、应用举例,1. 风湿骨痛胶囊麻黄定性鉴别和乌头总生物碱含量测定 风湿骨痛胶囊由制川乌、制草乌、红花、甘草、木瓜、乌梅、麻黄加工制备而成。 (1) 麻黄定性鉴别 取本品内容物5g，加浓氨试液0.5ml湿润，加氯仿50ml，加热回流提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，回收氯仿至干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录 B)试验，吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-浓氨试液(4:1:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105加热数分钟。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。,四、应用举例,(2)乌头总生物碱含量测定 对照品溶液的制备 精密称取经105干燥至恒重的乌头碱对照品10mg，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含乌头碱0.1mg)。 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，分别置分液漏斗中，依次精密加入氯仿至20ml，再精密加入pH3.0醋酸盐缓冲液(称取无水醋酸钠0.15g，加水使溶解，加冰醋酸5.6ml，用水稀释至500ml，摇匀，并在pH计上校正)10ml和0.1溴甲酚绿溶液(取溴甲酚绿0.2g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.2ml使溶解，用水稀释至200ml，摇匀)2ml，强力振摇5分钟，静置20分钟，分取氯仿层，用干燥滤纸滤过，滤液照分光光度法(附录 B)，分别在412nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。,四、应用举例,测定法 取装量差异项下的内容物，研细，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醚-氯仿-无水乙醇(16:8:1)的混合溶液25ml和氨试液1.5ml，摇匀，称定重量，于快速混匀器上振荡三次，每次2分钟，放置过夜，称定重量，用上述混合溶液补足减失的重量，再于快速混匀器上振荡2分钟，静置，倾取上清液，精密量取5ml，置分液漏斗中，加乙醚5ml，用0.05mol/L硫酸溶液提取4次，每次10ml，分取硫酸液，滤过，合并滤液，置另一分液漏斗中，加浓氨试液4ml，摇匀，用氯仿提取4次，每次10ml，分取氯仿层，滤过，合并滤液，蒸干，残渣于105加热1小时，取出，放冷，加氯仿分次溶解，转移至25ml量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，精密量取20ml，置分液漏斗中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入pH3.0醋酸盐缓冲液10ml”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中乌头碱的量(g/ml)，计算，即得。,四、应用举例,2. 止喘灵注射液生物碱的定性鉴别和含量测定 止喘灵注射液由麻黄、洋金花、苦杏仁、连翘加工制备而成。 (1)定性鉴别 取本品20ml，加氨试液使成碱性，用氯仿提取两次，每次10ml，合并氯仿液，取氯仿液4ml，分置2支试管中，一管加氨制氯化铜试液与二硫化碳各5滴，振摇，静置，氯仿层显黄色至黄棕色；另一管为空白，以氯仿5滴代替二硫化碳，振摇后氯仿层应无色或显微黄色。 取鉴别项下的氯仿液10ml，蒸至1ml，加甲醇1ml，充分振摇，滤过，滤液作为供试品溶液。另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录 B)试验，吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-浓氨试液(20:5:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105加热约5分钟。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。,四、应用举例,2)含量测定 总生物碱 精密量取本品10ml，置分液漏斗中，加1mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，用氯仿提取4次(10ml、10ml、5ml、5ml)，合并氯仿液，置具塞锥形瓶中，精密加硫酸滴定液(0.01mol/L)10ml及新沸过的冷水10ml，充分振摇，加茜素磺酸钠指示液12滴，用氢氧化钠滴定液(0.02mol/L)滴定至淡红色，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml硫酸滴定液(0.01mol/L)相当于3.305mg的麻黄碱(C10H15NO)。 东莨菪碱 照高效液相色谱法 (附录 D)测定。 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.07mol/L磷酸钠溶液(含17.5mol/L十二烷基硫酸钠用磷酸调pH值至6.0)(30:60)为流动相；检测波长为216nm。理论板数按氢溴酸东莨菪碱峰计算应不低于3000。 对照品溶液的制备 取氢溴酸东莨菪碱对照品适量，精密称定，用0.07mol/L磷酸钠溶液(用磷酸调pH值至6.0)溶解，制成每1ml含0.2mg的溶液，即得(东莨菪碱重量氢溴酸东莨菪碱/1.445)。 供试品溶液的制备 精密量取本品20ml，置分液漏斗中，加2mol/L盐酸溶液调pH值至2，用三氯甲烷20ml振摇提取1次，弃去三氯甲烷液，酸水层用浓氨试液调pH值至9，用三氯甲烷振摇提取5次，每次20ml，合并三氯甲烷液，置温水浴上回收三氯甲烷至干，残渣用0.07mol/L磷酸钠溶液(用磷酸调pH值至6.0)溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20l，注入液相色谱仪，测定，即得。,第二节 黄酮类,一、结构特征及理化性质 二、定性鉴别 三、含量测定 四、应用举例,一、结构特征及理化性质,一）结构特征 黄酮类化合物是指基本母核为2-苯基色原酮的一类化合物，现在泛指两个苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。根据中央三碳链的变化又可分为黄酮、黄酮醇、异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮、橙酮、花青素、黄烷等类型。,一、结构特征及理化性质,（二）理化性质 1. 物理性状 黄酮类化合物多为结晶性固体，少数(如黄酮苷)为无定形粉末。黄酮类化合物的颜色与分子中是否存在交叉共轭体系及助色团(-OH、-CH3等)的类型、数目以及取代位置有关。一般说来，黄酮、黄酮醇及其苷类多显灰黄色至黄色，查耳酮为黄至橙黄色；而二氢黄酮、二氢黄酮醇及黄烷醇因不存在交叉共轭体系，几乎无色；异黄酮因缺少完整的交叉共轭体系，仅显微黄色。 2. 溶解度 黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态不同而有很大差异。一般游离苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。其中，黄酮、黄酮醇、查耳酮等为平面型分子，难溶于水；二氢黄酮及二氢黄酮醇系非平面型分子，在水中溶解度稍大；异黄酮水溶性介于二者之间；花色素因以离子形式存在，具有盐的通性，亲水性较强。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，难溶或不溶于苯、氯仿、乙醚等有机溶剂中。糖链越长，则水中溶解度越大。,一、结构特征及理化性质,3. 酸碱性 (1)酸性 黄酮类化合物因分子中多有酚羟基，故显酸性。酚羟基数目及位置不同，酸性强弱不同，以黄酮为例，其酚羟基酸性强弱顺序为：7，4二OH 7-或4OH 一般酚-OH 5-OH。 (2)碱性 黄酮类化合物分子中-吡喃酮环上的1-位氧原子，因有未共用电子对，表现微弱碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成烊盐，产生特殊颜色，可用于鉴别。 4. 显色反应 黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及-吡喃酮环有关。 (1)还原反应 盐酸-镁粉反应：多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物显橙红色至紫红色，少数显紫色至蓝色。查耳酮、橙酮、儿茶素类则不显色。异黄酮除少数例外，也不显色。四氢硼钠反应：为二氢黄酮类化合物专属性较高的显色反应，二氢黄酮及二氢黄酮醇类显红色至紫红色，其它黄酮类均为负反应。 (2)金属离子络合反应 黄酮类化合物可与铝盐、锆盐、镁盐、锶盐、铁盐、铅盐等试剂反应，生成有色配合物。铝盐：常用试剂为1三氯化铝或硝酸铝溶液，生成的配合物多为黄色(max 415nm)，并有荧光，可用于定性及定量分析。锆盐：多用2二氯氧锆甲醇溶液。黄酮类化合物分子中有游离的3-或5-OH存在时，均可反应生成黄,一、结构特征及理化性质,色的锆配合物。但两种锆配合物对酸的稳定性不同，反应液中加入枸橼酸后，5-羟基黄酮黄色显著褪色，而3-羟基黄酮呈鲜黄色(锆-枸橼酸反应)。镁盐：常用试剂为醋酸镁甲醇溶液，纸片反应紫外灯下观察，二氢黄酮及二氢黄酮醇类显天蓝色荧光。铁盐：多数黄酮类化合物分子中含有酚羟基，可与三氯化铁水溶液或醇溶液发生显色反应，呈紫、绿、蓝等不同颜色。 5. 紫外光谱特征 多数黄酮结构中存在有桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭体系，故在200400nm波长区域内有强烈的吸收带，其中带I在300400nm范围内，由B环桂皮酰基系统引起，带在240285nm范围内，由A环苯甲酰基系统引起。加入一些位移试剂如甲醇钠、醋酸钠、三氯化铝等，可使最大吸收波长发生位移，有助于消除杂质干扰，提高选择性，有利于含量测定。,二、定性鉴别,一）显色反应 常用盐酸-镁粉反应。将中药制剂用适当方法提取分离，制成供试品液，取510ml，加入数滴盐酸，然后加入少量镁粉(必要时加热)，数分钟后出现红色至紫红色，说明含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮或二氢黄酮类化合物。为了避免中药提取液本身颜色的干扰，可注意观察加入盐酸后升起的泡沫颜色。如泡沫为红色，即示阳性。若黄酮类化合物分子中有游离的3-OH、5-OH或邻二酚羟基，则可与金属离子(如Al3+、Zr4+、Pb2+、Sr2+等)形成配合物，这些配合物有的产生荧光或颜色加深(如Al3+、Zr4+)，有的产生沉淀(如Pb2+、Sr2+)，可用于黄酮类成分的定性分析。,二、定性鉴别,（二）薄层色谱法 薄层色谱法是含黄酮类成分中药制剂最常用的定性分析方法。一般采用吸附薄层，常用吸附剂有硅胶、聚酰胺和纤维素等。 1. 硅胶薄层色谱 硅胶薄层色谱分离黄酮类化合物常用溶剂系统有：甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5:4:1)，苯-甲醇(95:5)(分离黄酮苷元)；苯-甲醇-乙酸(35:5:5)(分离黄酮苷)；氯仿-甲醇(8:2)(分离黄酮苷元及苷)；甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5:4:1)(分离双黄酮)等。显色方法多为三氯化铝显色后紫外灯下检视荧光。 2. 聚酰胺薄层色谱 聚酰胺薄层色谱用于分离含游离酚羟基的黄酮苷和苷元较好。聚酰胺对黄酮类成分的吸附能力较强，展开剂极性一般较大，大多含有醇、酸或水，或三者兼有。 3. 纤维素薄层色谱 纤维素薄层色谱用于分离黄酮苷类成分效果较好，原理与纸色谱相同，色谱流动相可套用纸色谱所用的流动相。常用的展开剂有：正丁醇-乙酸-水(4:1:5)；2甲酸、不同浓度的乙酸(6、10、40、60)；乙酸乙酯-甲酸-水(8:2:3)的上层溶液；异丙醇-氢氧化铵-水(8:1:1)。,三、含量测定,中药制剂中如含有黄酮类成分，可根据要求测定制剂中的总黄酮含量、黄酮类单体成分的含量或二者同时测定。 （一）总黄酮含量测定 黄酮类化合物多具有特定的紫外吸收峰，含黄酮类化合物的原料药及部分制剂经适当提取纯化后，可直接于最大吸收波长处测定吸收度，计算含量。在复方制剂中，由于其它组分吸收的干扰，多需进行显色测定，显色以后显色物与背景最大吸收波长差别较大，可消除背景(即阴性空白)干扰，提高方法的选择性及灵敏度。常用显色剂为三氯化铝和硝酸铝。醋酸钾-三氯化铝与黄酮显色后最大吸收波长为420nm，亚硝酸钠-硝酸铝与黄酮显色后最大吸收波长为500nm，二者皆可用于总黄酮的含量测定。,三、含量测定,（二）黄酮单体成分的含量测定 1. 薄层色谱法 薄层色谱法是测定中药制剂中黄酮单体成分的有效方法之一。样品经有机溶剂或水提取后，可用硅胶、纤维素或聚酰胺进行色谱分离。分离后可将含有待测组分的色斑刮下，再用适当的溶剂洗脱后，用紫外-可见分光光度法测定；也可用薄层扫描仪(单波长或双波长法)直接在薄层板上扫描测定。目前在中药制剂的薄层色谱法分析中以应用后者居多。 2. 高效液相色谱法 黄酮类化合物在紫外光区有较强的吸收，使用HPLC-UV法检测，灵敏度很高。如中药制剂中含有黄酮类化合物，只要经过适当的预处理，并选择好色谱条件，一般都能得到较满意的结果。黄酮类成分的HPLC条件多选择反相色谱，用C18键合相作固定相，流动相常用甲醇-水-乙酸(或磷酸缓冲液)及乙腈-水。检测器主要采用紫外检测器或荧光检测器。,四、应用举例,1. 双黄连口服液黄芩定性鉴别和黄芩苷含量测定 双黄连口服液由金银花、黄芩、连翘加工制备而成。 (1)黄芩定性鉴别 取本品1ml，加75乙醇溶液5ml，摇匀，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品，加75乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录 B)试验，吸取上述三种溶液各12l，分别点于同一聚酰胺薄膜(5cm7cm)上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。,四、应用举例,(2)黄芩苷含量测定 照高效液相色谱法 (附录 D)测定。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-冰醋酸(50:50:1)为流动相；检测波长为274nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于1500。 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品10mg，置100ml量瓶中，加50甲醇适量，置水浴中振摇使溶解，放置至室温，稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含黄芩苷0.1mg)。 供试品溶液的制备 精密量取装量项下的本品1ml，置50ml量瓶中，加50甲醇适量，超声处理20分钟，放置至室温，加50甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5l，注入液相色谱仪，测定，即得。,第三节 三萜皂苷类,一、结构特征及理化性质 二、定性鉴别 三、含量测定 四、应用举例,一、结构特征及理化性质,（一）结构特征 三萜类化合物结构根据异戊二烯定则可视为6个异戊二烯单位聚合而成，一般根据三萜类化合物碳环的有无和多少进行分类。目前已发现的三萜类化合物，多数为四环三萜和五环三萜。三萜皂苷由三萜皂苷元和糖、糖醛酸(部分化合物还含有机酸)所组成。糖大多数和皂苷元的C3-OH相连，少数情况C3-OH游离，而糖和其他位置羟基相连。皂苷元分子中羟基大部分和糖结合，形成苷，少数可与有机酸结合，形成酯。,一、结构特征及理化性质,（二）理化性质 1. 物理性质 三萜皂苷分子大，不易结晶，大多数为白色或乳白色无定形粉末，仅少数为结晶体，皂苷元大多有完好的结晶。皂苷多数具有苦和辛辣味， 具有吸湿性。三萜皂苷有降低水溶液表面张力的作用，其水溶液经强烈振摇能产生持久性的泡沫，不因加热而消失。三萜皂苷的熔点都很高，常在融熔前分解，分解点多在200350之间。 2. 溶解度 三萜皂苷一般可溶于水，易溶于热水、含水稀醇、热甲醇和热乙醇中，几不溶于或难溶于丙酮、乙醚、苯等极性小的有机溶剂。皂苷在含水丁醇或戊醇中溶解度较好。三萜皂苷元能溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿等有机溶剂，而不溶于水。 3. 金属盐类的反应 三萜皂苷的水溶液可以和一些金属盐类，如铅盐、钡盐、铜盐等产生沉淀。但酸性皂苷水溶液，加入中性盐类即生成沉淀；中性皂苷水溶液则需加入碱式醋酸铅或氢氧化钡等碱性盐类才能产生沉淀。,一、结构特征及理化性质,4. 显色反应 三萜化合物在无水条件下，与强酸(硫酸、磷酸、高氯酸)、中强酸(三氯乙酸)或Lewis酸(氯化锌、三氯化铝、三氯化锑)作用，会出现一系列显色变化或荧光。常见显色反应有： (1)醋酐-浓硫酸反应(Liebermann-Burchard反应) 将样品溶于醋酐中，加浓硫酸-醋酐(1:20)，产生黄-红-紫-蓝等颜色变化，最后褪色。 (2)五氯化锑反应(Kahlenberg反应)：将样品氯仿或醇溶液点于滤纸上，喷以20五氯化锑氯仿溶液(不应含乙醇和水)，干燥后6070加热，显蓝色、灰蓝色、灰紫色斑点。 (3)三氯醋酸反应(Rosen-Heimer反应) 将样品溶液滴在滤纸上，喷25三氯醋酸乙醇溶液，加热100，生成红色渐变为紫色。 (4)冰醋酸-乙酰氯反应(Tschugaeff反应) 样品溶于冰醋酸中，加乙酰氯数滴及氯化锌结晶数粒，稍加热，则呈现淡红色或紫红色。 (5)氯仿-浓硫酸反应(Salkowski反应) 样品溶于氯仿，加入浓硫酸后，在氯仿层呈现红色或蓝色，硫酸层有绿色荧光出现。 5. 光谱特征 除少数化合物如甘草酸、远志皂苷等外，大多数三萜化合物无明显的紫外吸收或仅在200nm附近有末端吸收。,二、定性鉴别,对中药制剂中含有的三萜皂苷类成分进行定性鉴别，常用方法有泡沫反应、显色反应和薄层色谱法。其中薄层色谱法应用最广泛，鉴别准确率较高。而泡沫反应、显色反应在检识含皂苷的原料药中较为多用，用于皂苷类成分含量较高、组成药物较少的中药制剂鉴别时，要考虑适当的提取方法和其他成分的干扰，并应作空白对照。 1. 泡沫反应 鉴别时取样品一定量，加水10ml，煮沸，滤过，将滤液于试管内强烈振摇，如产生持久性泡沫(15分钟以上)即为阳性反应。 2. 显色反应 显色反应对于原料药和制剂来说，由于样品自身的背景颜色较深，不易判断，故实际应用较少，仅在组成药味简单的中药制剂中使用。,二、定性鉴别,3. 薄层色谱法 样品经薄层色谱分离后选用适当的显色剂显色观察，是皂苷类成分定性鉴别中最常用的方法。三萜皂苷类成分多用硅胶为吸附剂，也可选择氧化铝、硅藻土等作为吸附剂。三萜皂苷一般极性较大，展开剂极性亦较大，常用溶剂系统有：氯仿-甲醇-水(13:7:2，10以下放置，下层)、正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)、正丁醇-3mol/L氢氧化铵-乙醇(5:2:1)、氯仿-甲醇(7:3)、正丁醇-乙酸-水(4:1:5，上层)等。三萜皂苷元极性较小，如以硅胶为吸附剂，展开剂要有较强的亲脂性，所用溶剂系统常以苯、氯仿、己烷、异丙醚等为主要组分，再加以少量其他极性溶剂。常用溶剂系统有环己烷-乙酸乙酯(1:1)、苯-乙酸乙酯(1:1)、氯仿-丙酮(9:1)、氯仿-乙酸乙酯(1:1)、苯-丙酮(1:1)、氯仿-乙醚(1:1)、苯-乙醇(17:3)等。显色剂可选用三氯醋酸、氯磺酸-醋酸、硫酸、三氯化锑、磷钼酸、醋酐-浓硫酸、碘蒸气等，其中以不同浓度的硫酸乙醇液为最常用。,三、含量测定,中药制剂中皂苷类成分的定量分析可分为总皂苷(元)测定和皂苷(元)单体成分测定。 （一）总皂苷(元)含量测定 总皂苷的含量测定一般需要用适当的溶剂提取。由于皂苷在极性溶剂中溶解度较大，因此提取溶剂可为各种浓度的甲醇(7095)、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇。提取后经分离得到总皂苷成分，分离可用有机溶剂，如水饱和的正丁醇萃取，也可用大孔吸附树脂处理后溶剂洗脱。总皂苷元的含量测定可按上述总皂苷的提取分离方法得到总皂苷，再加酸(如硫酸、盐酸)加热水解，得到皂苷元；也可以将样品先行水解，再用有机溶剂从水解后的混合液中提取皂苷元。测定总皂苷(元)最常用的方法是重量法和比色法。,三、含量测定,1. 重量法 根据三萜皂苷类成分的溶解性进行提取、分离及纯化后得总皂苷，恒重，称量并计算样品中总皂苷含量，该方法主要用于含皂苷的原料药质量控制。在中药制剂中，如处方中药味含皂苷类成分较多时，常用正丁醇作溶剂，测定正丁醇浸出物。 2. 比色法 利用三萜皂苷能与某些试剂反应后产生颜色，进行比色测定。皂苷类成分的颜色反应专属性虽较差，但反应比较灵敏，方法简便、易行。常用显色剂有香草醛-硫酸、香草醛-高氯酸、醋酐-硫酸、高氯酸、浓硫酸以及亚甲蓝等。用比色法测定中药制剂中总皂苷或总皂苷元的含量时，可选用单体皂苷或皂苷元作对照品，但要注意测定单体皂苷或皂苷元与总皂苷的换算系数。,三、含量测定,（二）皂苷单体成分含量测定 皂苷单体成分的含量测定方法主要为薄层色谱法和高效液相色谱法。直接用紫外分光光度法测定的不多。 1. 薄层色谱法 薄层色谱法在皂苷类成分的定量分析中占主导地位。样品经适当的提取、纯化后，用薄层色谱法分离，可排除其他组分的干扰，常用于测定中药制剂中的单体皂苷或皂苷元，定量方法可采用薄层洗脱-比色法或薄层扫描法。,三、含量测定,2. 高效液相色谱法 大多数三萜皂苷类成分，如人参皂苷、三七皂苷等可利用其在紫外区的末端吸收，用紫外检测器来检测，但灵敏度相对较低。少数三萜皂苷类成分本身具有较强的紫外吸收，如甘草酸、远志皂苷等，可用HPLC法分离并用紫外检测器检测。近年来，随着高效液相色谱检测器技术的发展，蒸发散射检测器(ELSD)的出现，使得高效液相色谱法检测三萜皂苷类成分的文献报道越来越多。用ELSD检测，系统平衡快(大约30分钟)，基线稳定，重现性、灵敏度较好，且通过自然对数拟合，峰面积值与进样量之间呈良好的线性关系，结果较准确；而用UV检测，系统平衡慢(12小时)，基线不稳定，重现性、灵敏度较差，当样品含量较低时测定结果误差较大。,四、应用举例,乙肝宁颗粒黄芪定性鉴别和黄芪甲苷含量测定 乙肝宁颗粒由黄芪、白花蛇舌草、茵陈、金钱草、党参、蒲公英、制何首乌、牡丹皮、丹参、茯苓、白芍、白术、川楝子加工制备而成。 (1)黄芪定性鉴别 取本品1袋，加甲醇50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用以水饱和的正丁醇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，加1氢氧化钠溶液洗涤2次，每次20ml，取正丁醇液用以正丁醇饱和的水洗至中性，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(20:40:22:10)10以下放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10硫酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。,四、应用举例,(2)黄芪甲苷含量测定 照高效液相色谱法 (附录 D)测定。 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水 (75:25)为流动相；用蒸发光散射检测器检测。温度40。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于2000。 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60g的溶液，即得。 供试品溶液的制备 取本品，研细，取约5g，精密称定，加水20ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液20ml分2次洗涤，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液10L、30L及供试品溶液20L，注入液相色谱仪，用外标两点法对数方程计算，即得。,第四节 醌类,一、结构特征及理化性质 二、定性鉴别 三、含量测定 四、应用举例,一、结构特征及理化性质,（一）结构类型及特征 醌类化合物主要有苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌四种类型。苯醌类化合物可分为邻苯醌及对苯醌两大类。前者不稳定，天然存在的苯醌化合物多为对苯醌的衍生物，且在醌核上多有-OH、-OCH3、-CH3等基团或更长的烃类侧链取代。萘醌类化合物分为(1，4)、(1，2)及amphi(2，6)三种类型，天然存在的大多为-萘醌类衍生物。天然菲醌衍生物包括邻醌(A)及对醌(B)两种类型。蒽醌则可分为氧化型和还原型，单蒽核和双蒽核等，常见类型包括蒽醌、蒽酚、氧化蒽酚、蒽酮、二蒽酮、二蒽醌等。中药中存在的蒽醌类成分多为蒽醌的羟基、羟甲基、甲氧基和羰基衍生物，可呈游离形式或糖结合成苷的形式存在。,一、结构特征及理化性质,（二）理化性质 1. 物理性状 醌类化合物分子中多有酚羟基等助色团取代，表现出一定的颜色如黄、橙、棕红色以至紫红色等。游离醌类多为有色晶体，结合成苷后，多数难以得到良好结晶。游离醌类多具有升华性，小分子的苯醌及萘醌类具有挥发性，能随水蒸气蒸馏。游离醌类多溶于乙醇、乙醚、苯、氯仿等有机溶剂，微溶于或不溶于水。结合成苷后极性增大，易溶于甲醇、乙醇中，在热水中也可溶解，几乎不溶于苯、乙醚、氯仿等非极性溶剂中。有些醌类化合物对光不稳定，须避光贮存。 2. 酸性 蒽醌类化合物分子中多具有酚羟基，具有一定酸性，在碱性水溶液中易溶，但加酸酸化时又可重新沉淀析出。 3. 显色反应 醌类化合物的颜色反应主要取决于其氧化还原性质以及存在的酚羟基的性质。 (1)碱性条件下的呈色反应 羟基蒽醌类在碱性溶液中会引起颜色改变并加深，多呈橙、红、紫红色及蓝色。蒽酚、蒽酮、二蒽酮类化合物则需经过氧化形成蒽醌后才能呈色。 (2)与金属离子的反应 在蒽醌类化合物结构中，如果有-酚羟基或具有邻二酚羟基时，则可与Pb2+、Mg2+等金属离子形成配合物。 (3)与对亚硝基二甲苯胺反应 9位或10位未取代的羟基蒽酮类化合物，尤其是1，8-二羟基衍生物，可与对亚硝基二甲苯胺反应，缩合产生各种颜色，如紫色、绿色、蓝色及灰色等。,二、定性鉴别,1. 显色反应 将中药制剂用适当方法提取分离，制成供试品溶液，利用碱性条件下的呈色反应或醋酸镁显色反应等可对羟基蒽醌类成分进行鉴别。 2. 升华法 游离醌类化合物具有升华性。中药制剂中如含有这类成分，且量较大时，可采用升华法得到升华物，可见光下观察或加碱性试液显色。 3. 薄层鉴别 薄层色谱法是中药制剂中醌类成分最主要的定性鉴别方法。吸附剂多用硅胶。展开剂大多使用混合溶剂，且多含有水或甲醇，其中乙酸乙酯-甲醇-水(100:16.5:13.5或相近的比例)是用途最广的展开剂，适于分离蒽醌苷元和蒽醌苷。正丙醇-乙酸乙酯-水(4:4:3)和异丙醇-乙酸乙酯-水(9:9:4)适于分离番泻苷和二蒽酮苷。不含水或甲醇的混合溶媒适合于分离蒽醌苷元。显色方法主要有喷碱性试剂或醋酸镁甲醇液、氨气熏及在紫外灯下观察荧光，亦可在可见光下直接观察色斑。,三、含量测定,（一）蒽醌类成分含量测定 1. 游离蒽醌的测定 游离蒽醌的测定多将样品用弱极性溶剂如乙醚、氯仿等提取后加碱比色测定。具体方法是称取样品适量，置索氏提取器中，用氯仿回流提取至无色。氯仿提取液移入分液漏斗中，以5氢氧化钠-2氢氧化铵混合碱液分次提取至无色，合并碱液，用少量氯仿洗涤，氯仿弃去，碱液调整至一定体积，若不澄清，可用垂熔漏斗过滤，滤液在沸水浴中加热4分钟，用冷水冷却至室温，30分钟后比色测定，以1，8-二羟基蒽醌为对照品，计算含量。 2. 结合蒽醌的测定 蒽醌苷类成分极性较强，可以用极性溶剂提取，通常是取游离蒽醌测定项下的药渣将苷提出，水解成苷元后再测定；也可将药渣先行酸水解，然后用非极性溶剂提取苷元后测定；或取待测样品先行酸水解，然后用非极性溶剂提取苷元后测定，其结果为总蒽醌含量，从中减去游离蒽醌含量，即得结合蒽醌的含量。,三、含量测定,3. 蒽醌类单体成分的测定 中药制剂中蒽醌类单体成分的测定一般采用薄层扫描法和高效液相色谱法。薄层扫描法为蒽醌类成分常用定量分析方法，经色谱分离后，可在可见光、紫外光及荧光下扫描测定。蒽醌类成分在紫外及可见光下均有强吸收，利用高效液相色谱-紫外可见光检测器测定蒽醌类单体成分，具有灵敏、准确、简便等特点。在含蒽醌类化合物的中药制剂分析中应用很多。 （二）萘醌、菲醌类成分含量测定 重量法、分光光度法常用于测定萘醌、菲醌类总成分含量；薄层色谱法、高效液相色谱法常用于测定萘醌、菲醌类单体成分含量。,四、应用举例,三黄片大黄定性鉴别和含量测定 三黄片由大黄、盐酸小檗碱、黄芩浸膏加工制备而成。 (1)大黄定性鉴别 取本品5片，除去糖衣，研细，加甲醇30ml，加热回流提取30分钟，放冷，滤过，取滤液5ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置热水浴中加热30分钟，立即冷却，用乙醚提取2次，每次10ml，合并乙醚提取液，挥去乙醚，残渣加醋酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取大黄酚、大黄素对照品，加甲醇制成每1ml中各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录 B)试验，吸取上述三种溶液各5l，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(3060)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的5个橙黄色荧光主斑点，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；置氨蒸气中熏后，日光下检视，斑点变为红色。,四、应用举例,(2)含量测定 照高效液相色谱法(附录 D)测定。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1磷酸溶液(85:15)为流动相；检测波长为254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于2000。 对照品溶液的制备 分别精密称取大黄素和大黄酚对照品适量，加无水乙醇-醋酸乙酯(2:1)制成每1ml含大黄素0.01mg、大黄酚0.025mg的混合溶液，即得。 供试品溶液的制备 取本品20片，除去包衣，精密称定，研细(过三号筛)，精密称取适量(约相当于1片的重量)，置锥形瓶中，精密加乙醇25ml，密塞，称定重量，置水浴上加热回流1小时，放冷，用乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，置烧瓶中，水浴蒸干，加30乙醇-盐酸(10:1)溶液15ml，置水浴中加热水解1小时，立即冷却，用氯仿强力振摇提取4次，每次15ml，合并氯仿液，置水浴上蒸干，残渣用无水乙醇-醋酸乙酯(2:1)溶解，移置25ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45m)滤过，取续滤液，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10l，注入液相色谱仪，测定，即得。,第五节 挥发油类,一、结构特征及理化性质 二、定性鉴别 三、含量测定 四、应用举例,一、结构特征及理化性质,（一）结构特征 挥发油所含成分相当复杂，一种挥发油常含有几十种到一二百种成分。按其化学结构，可分为萜类化合物、脂肪族化合物及芳香族化合物等。单萜、倍半萜及其含氧衍生物是组成挥发油的主要成分，其中含氧衍生物大多生物活性较强，并具有芳香气味，如薄荷醇、薄荷酮、樟脑、龙脑、茴香酮、苍术酮等。脂肪族化合物多为小分子，如正庚烷、正癸烷、辛烯、甲戊酮、醋酸乙酯、乙酸戊酯、丁酸己酯、异戊酸、异戊醛(存在于薄荷油)、癸酰乙醛(即鱼腥草素，存在于鱼腥草油)等。芳香族化合物则包括苯丙烷衍生物，具有C6-C3骨架，如桂皮醛、丁香酚；以及一些具有C