《外源基因的表达》PPT课件.ppt

外源基因的表达,第一节 基因表达的机制 1.外源基因的转录 2.mRNA的延伸与稳定性 3.外源基因mRNA的有效翻译 4.表达蛋白在细胞中的稳定性 5.目的基因的沉默,1.外源基因的转录 启动子类型： 组成型启动子 原核生物T7启动子 诱导型启动子 原核生物lac、trp等 组织特异性表达启动子,2.mRNA的延伸与稳定性 原核生物避免序列存在衰减子(attenuator) 带有正常转录终止序列 受体细胞情况,A,B,trp衰减子,带有正常转录终止序列 真核生物要带有转录终止序列与poly(A) 渗入位点 poly(A)渗入信号序列AAUAAA,受体细胞情况 原核生物 最佳选择RNase缺失个体 真核生物 mRNA正确加工，提高稳定性,3.外源基因mRNA的有效翻译 原核生物 AUG(ATG)首选起始密码子 SD序列 SD与起始翻译密码子间合适距离 翻译起始区周围不易形成明显的二级结构,真核生物 具有类似于SD序列的保守区CCA(G)CCATGG 对于翻译效率仍然十分重要 密码子偏爱性 主密码子(major codon) 罕用密码子(rare codon),翻译终止 UAA UAG UGA 释放因子(release factor) 原核 RF1 UAA UAG RF2 UAA UGA 真核 两种eRF UAA 终止效率最高,4.表达蛋白在细胞中的稳定性 受体细胞存在的蛋白水解酶可降解外源蛋白 避免或降低被水解的途径: 构建融合蛋白表达系统 构建分泌蛋白表达系统 构建包涵体表达系统 选择蛋白水解酶缺陷型受体系统,5.目的基因沉默 基因沉默(gene silencing) 位置效应 转录水平(TGS) 甲基化 转录后(PTGS) siRNA,1.启动子(promoter) 序列特异性 方向性 顺式调控元件 位置特性 转录区上游 种属特异性,第二节 基因表达调控元件,(1)原核生物启动子 转录起始位点 Pribnow框 Sextama框 间隔区,(2)真核生物启动子 I型启动子 rRNA II型启动子 mRNA TATA框 CAAT框 GC框 III型启动子 tRNA 5SrRNA sRNA,(3)启动子与转录的启动 原核亚基参与起始 真核生物转录启动较复杂,(4)启动子的分离 随机克隆法,HindIII EcoRI,聚合酶保护法,B,A B,过滤膜结合法 PCR方法,2.增强子(enhancer) 双向性 重复序列 与所处位置无关 特异性 可增强异源基因,3.终止子(terminator) 常用大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2 噬菌体上T 4.衰减子(attenuator) 5.绝缘子(insulator) 6.反义子(antisense RNA),第三节 外源基因表达系统,原核表达系统 真核表达系统,目前广泛应用的为原核系统特点 大肠杆菌、芽胞杆菌、链霉菌等 单细胞、生长快、易控制 基因组结构简单 含质粒或噬菌体 生理代谢途经与基因表达调控比较清楚 不具备真核生物蛋白加工系统 内源蛋白酶会降解外源蛋白，表达产物不稳定,一.大肠杆菌表达系统,1.大肠杆菌表达载体 (1)复制子 高拷贝 pMB1、p15A、ColE1等 低拷贝 pSC101等 (2)启动子与终止子,(3)核糖体结合位点(SD) AGGAGG 翻译起始密码子与SD的距离 SD后为AAAA或UUUU效率最高 (4)密码子 (5)选择标记,2.宿主菌 蛋白水解酶缺陷型 菌株如:BL21等,3.常见大肠杆菌表达系统 Lac和Tac标达系统 以lac操纵子调控机 制为基础设计和构建 的表达系统,阻遏蛋白过量表达 当带lac操纵区的基因多拷贝存在，lacI表达的阻遏蛋 白不够用时，采用阻遏蛋白过量表达突变体 lacI突变体lacIq 温度敏感型突变体lacIq(ts) 30C抑制表达 42C转录保持开放,PL和PR表达系统 cI基因表达蛋白阻遏PL和PR表达 cI基因温度敏感型突变体cI857(ts) T7表达系统 T7噬菌体RNA聚合酶高效率转录 在大肠杆菌内，存在T7噬菌体RNA聚合酶 下，T7启动子可高效转录,4.外源基因在大肠杆菌表达的形式 外源基因在大肠杆菌中的表达产物可能 存在于： 细胞质、细胞周质、细胞外培养基 表达蛋白形式 可溶性蛋白 不可溶性蛋白,包涵体 (inclusion body)表达蛋白,一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累，并致密地聚集在一起，形成无膜的或被膜的裸露结构 分布位置 主要存在于细胞质中，也存在于细胞周质 构成 主要为表达的外源蛋白，还有RNA聚合酶、核糖核蛋白体等，此外还包括一些DNA、RNA、脂多糖等非蛋白成分,包涵体的形成,折叠状态的蛋白聚集作用 高表达导致水难溶的折叠态蛋白分子间相互作 用而聚在一起 非折叠态的蛋白聚集作用 在较高培养温度的细菌中，热稳定性差的蛋白 处于非折叠态，以二硫键等结合在一起 蛋白折叠中间体的聚集作用 由于折叠中间体的难溶而聚在一起,包涵体表达的优缺点 包涵体表达的优点： 简化外源表达蛋白的分离 保持表达产物结构稳定 包涵体表达的缺点： 表达的外源蛋白丧失了原有生物活性，必须经过有效的变性、复性操作，才能得到具有正确空间构想的活性蛋白体,融合蛋白 外源蛋白基因与受体菌蛋白基因重组，不改变两个基因的阅读框，表达的蛋白为融合蛋白,Gene,Protein,A B,A B,融合蛋白的优点： 在自身蛋白引导下，形成良好的杂合构象，可很大程度封闭蛋白水解酶切割位点 某些情况下，具有水溶性和一定生物活性 易于分离纯化,寡聚型外源蛋白 低拷贝质粒，多基因串联排列。目的蛋白高表达，非目的蛋白低表达。 多个转录元排列 大分子量蛋白 同于转录元，多编码框排列 中等分子量蛋白 同一编码框，多肽段排列 小分子量蛋白,整合型外源蛋白 分泌型外源蛋白 在信号肽引导下分泌到胞外或周质中,5.高效表达外源基因的策略 优化载体设计 密码子偏爱性 mRNA稳定性 表达蛋白稳定性 优化发酵过程,二.酵母表达系统,酵母(yeast)是一类芽殖或裂殖进行无性生殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲和半知菌纲，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。,基因表达调控机制比较清楚，遗传操作简单 1996年完成了酿酒酵母全基因组测序 具备蛋白翻译后的加工和修饰系统 可将外源基因表达产物分泌到培养基中 安全性好，对人与环境无害 可进行大规模发酵，工艺较简单,酵母表达外源基因的优势,载体一般包含的元件 DNA复制起始区 酵母自主复制序列 来源于天然2质粒 YEp 来源于酵母自主复制序列(ARS) YRp 选择标记 营养缺陷型选择标记 显性选择标记 有丝分裂稳定区(CEN) YCp,酵母表达载体,表达盒(expression cassette) 启动子、分泌信号序列、终止子 启动子上游含有各种调控元件 如: 上游激活序列(UAS) 上游阻遏序列(URS) 组成型启动子序列,酵母表达宿主菌,酿酒酵母 应用与研究最早 乙醇积累影响酵母生长与基因表达 蛋白过度糖基化 分泌能力不强 巴斯德毕赤酵母 甲醇营养菌 甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶高效表达 利用甲醇诱导的乙醇氧化酶基因AOX1启动子 高效表达外源基因,三.哺乳动物细胞基因表达系统,哺乳动物细胞基因表达系统的优势 更好的蛋白辅助折叠系统 蛋白糖基化、磷酸化、寡聚体、二硫键形成等蛋白加工系统 可直接表达具有完全生物功能的活性蛋白,哺乳动物表达载体 载体一般包含的元件 哺乳动物细胞中进行基因转录的元件 启动子、增强子、终止子、poly(A)信号、内含子剪切信号 基因表达调控元件 细菌中进行复制和筛选的元件 筛选转化子的选择标记,常用筛选转化子的选择标记,哺乳动物常用表达载体,哺乳动物常用受体细胞,三.植物基因表达系统 一个转基因细胞就可发育成一株转基因个体 可得到一个转基因的完整生命系统 培养条件简单、生产成本低,植物表达载体 载体大多数情况以Ti质粒为基础构建 T-DNA序列 含有植物基因表达的启动子、终止子等元件 含有选择标记基因与报告基因,植物基因表达受体 愈伤组织再生系统 直接分化再生系统 原生质体再生系统 胚状体再生系统 生殖细胞受体系统,第四节 基因表达产物的检测与分离纯化,一.基因表达产物的检测 (1)转录产物检测 Northern blot (2)报告基因酶法检测 GUS基因等 (3)免疫学检测 ELISA、Western blot等 (5)酶活性检测,二.基因表达产物的分离纯化 (1)