扫描电子显微镜(制样).ppt

扫描电子显微镜 （Scanning Electron Microscopy SEM）,材化0801 孟岩 李民 王洪志 张俊,扫描电子显微镜 （Scanning Electron Microscopy SEM） 1942年 第一台扫描电子显微镜 60年代 分辨率和图像质量的大大的改善 80年代 广泛应用于医学、生物学等领域 90年代 高分辨型扫描电镜的分辨率0.2nm,扫描电镜与透射电镜结构比较 1 照明系统结构和原理基本相同 都是由电子枪和聚光镜等来完成照明工作 2 SEM 没有中间镜和投影镜，但增加了 二次电子探测器、扫描偏转线圈、显像管等 3 SEM 样品室比 TEM 大，位置不同 4 SEM 与 TEM 真空系统、水冷系统和电源系统 的结构和功能基本相似。,如细菌、血细胞、培养细胞的整体形态、大 小、表面突起和细胞间的相互关系 消化道、血管等空腔组织的表面结构 骨等硬组织形貌以及生物材料的形状结构等,景深长，视野广、图像富有立体感 用于观察组织细胞的表面和断面的形貌,扫描电镜特点,1、 电子光学系统（镜筒） 2、 信号检测及显示系统 3、 电源和真空系统,一、扫描电镜的基本结构,第一节 扫描电镜的结构和工作原理,镜中图像,电子枪和透镜： 电子枪产生电子经透镜会聚成电子束（探针） 投射在样品表面(约10nm) 扫描线圈:（偏转线圈） 位于透镜和物镜之间，有两组扫描线圈（在显 像管也有两组）作用是控制电子束在X、Y两个方向规律的运动 样品室: 样品室较大，位于物镜的下方，室内有样品台、二次电子检测器、抽气管道和更换样品的窗口,（一）电子光学系统（镜筒）,二次电子探测器： 由收集器、闪烁体、光导管和光电倍增管成 二次电子探器是扫描电镜的眼睛，其作用是 收集扫描样品发生的二次电子信号并将它变成显像管的图像信号 显示系统： 显像管及电路组成，将电信号处理成最终影像,(二) 信号检测及显示系统,（三）电源和真空系统, 电子枪发射电子，经透镜聚焦形成很细 的电子束班（约10nm）称电子探针 电子探针打在样品表面，把样品表面原 子外层的电子打落形成 二次电子 （二次电子的产生率主要与样品表面材料的性质及入射角的角度有关，入射角越大，二次电子的发射就越多）,二、扫描电镜的工作成像原理,二次电子信息被收集转换和放大，变成可供观察和拍摄的影像 由于二次电子产生的多少与电子束入射 角度及样品表面的起伏有关，所以在荧光屏 上会得到样品表面形貌的立体图像,生物样品分为二大类: 含水组织 含水量少的组织,第二节 扫描电子显微镜样品制备技术,样品台,此类样品一般含有硅质、钙质、角质等成分 表面不易变形和收缩(如毛发、牙齿等) 这类标本处理较简单，只需表面清洁，就可 直接喷镀金属膜进行电镜观察,1、含水量少的硬组织,这类组织在生物样品中占多数 大多数生物组织的含水量都在80%以上 必须对样品进行特殊处理： 经固定、脱水、干燥、镀膜导电等过程,2、另一类是含水量较高的组织,样品制备过程中必须注意的三个关键技术： 1、生物样品观察面的暴露 尽可能暴露出所观察组织的原貌 2、生物样品的干燥 在脱去组织中水分的同时又不引起形态的变形 3、生物样品的导电 使样品具有导电性并能得到清晰的二次电子像,更多内容欢迎莅临天马行空官方博客：/tmxk_docin,取 材 充分暴露并保护好观察面 （10mm25mm） 清 洗 用生理盐水仔细漂洗观察面 固 定 2%戊二醛和1%锇酸固定 脱 水 丙酮脱水，醋酸异戊酯置换 干 燥 临界点干燥 镀 膜 离子溅射镀膜或真空镀膜 SEM观察,常 规 样 品 制 备 程 序,取材的基本要求和TEM样品制备相同 样品可大一些（810mm2，高度可达5mm） 扫描观察的部位常常是标本的表面 如气管表面、胃、肠粘膜表面等 要把观察的结构暴露出来 对易卷曲的样品可固定在滤纸上 以充分暴露待观察的组织表面,（一）取材,扫描电镜对样品表面的清洁要求十分严格 表面血液、粘液等必须清洗干净 可采用以下方法： 1.等渗生理盐水或缓冲液仔细地漂洗 或用针筒反复冲洗 2.对粘液物质过分粘稠，难以去除的标本 可采用酶消化方法进行处理 3.用5%的苏打水清洗,（二）清洗,清洗后应立即固定 由于样品体积较大，固定时间应适当延长 逐级增高浓度的丙酮或乙醇脱水 然后进入中间液（醋酸异戊酯：与CO2互溶性很好）置换,（三）固定,（四）脱水, 样品经脱水后，仍被脱水剂占有 必须除去脱水剂，使其真正干燥 干燥会引起样品体积变化和表面改变，要保存生物样品表面的微细结构又要使生物样品达到干燥的目的就要避免表面张力的影响 现有的方法： 1、 临界点干燥法 2、 冷冻干燥法 3、 空气干燥法等 。,（五）干燥, 目的是避免表面张力的影响，较好地保存 样品的微细结构 利用物质在临界状态时表面张力等于零 的特性，使样品的液体完全气化并以气体 方式排掉，来达到标本干燥的目的,1.临界点干燥法,物质有固体、液态和气态三种状态 通常以单相状态存在，温度和压力改变时互相转化 每一种物质都有所谓“临界状态” （即临界温 度，此时，液体的表面张力系数为零），物质不能以 液态继续存而要变成气体，这时的气体无论在 多大的压强下都不会变成液体,利用液体CO2（临界状态31 ）置换醋酸异戊酯,原理：,生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差，当入射电子束打到标本上时，就会产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响周围电子束的扫描和二次电子的发射，严重影响成像甚至无法成像 因此，必须给标本喷镀一层薄薄的导电金属，使样品具有导电性，增加二次电子发射量，提高样品的亮度和反差。 方法有：1.离子溅射法 2.金属喷镀法等,（六）镀膜,将需要喷镀的金属制成阴极靶，样品放在阳极上 容器内抽真空并通入一些惰性气体如氮、氖等 两极间加电场后产生辉光放电 气体电离产生的阳离子轰击阴极金属靶 使金属原子溅射出来在电场的加速下飞向样品,1.离子溅射法 (Ion sputter), ,阴极,阳极,样品,气体,两极间加电场