SN∕T 3306.2-2012 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第2部分；产毒素霍乱弧菌

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖犜 国境口岸环介导恒温扩增（ 犔 犃 犕 犘 ） 检测方法 第 部分： 产毒素霍乱弧菌 犔 狅 狅 狆 犿 犲 犱 犻 犪 狋 犲 犱 犻 狊 狅 狋 犺 犲 狉 犿 犪 犾 犪 犿 狆 犾 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱犪 狋 犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 犘 犪 狉 狋 ：犆 犺 狅 犾 犲 狉 犪 狋 狅 狓 犻 狀 狆 狉 狅 犱 狌 犮 犻 狀 犵犞 犻 犫 狉 犻 狅犮 犺 狅 犾 犲 狉 犪 犲 发布 实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 书书书 犜 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 国境口岸环介导恒温扩增（ 犔 犃 犕 犘） 检测方法 第部分： 产毒素霍乱弧菌 中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京市朝阳区和平里西街甲号（ ） 北京市西城区三里河北街 号（ ） 总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷 印数 书号： 定价 元 书书书 前 言 国境口岸环介导恒温扩增（ ） 检测方法 共分为部分： 第部分： 鼠疫杆菌； 第部分： 产毒素霍乱弧菌； 第部分： 志贺氏菌； 第部分： 嗜肺军团菌。 本部分为 的第部分。 本部分按照 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位： 中华人民共和国上海出入境检验检疫局、 中华人民共和国天津出入境检验检疫 局、 中国疾病预防控制中心、 广州华峰生物科技有限公司。 本部分主要起草人： 田桢干、 左锋、 查期、 鞠志英、 陆晔、 章琪、 方筠、 李晓虹、 王传现、 何宇平、 李平、 卢钟山、 王婷、 阚飚、 曹以诚、 杜正平、 陈洵。 犛 犖犜 国境口岸环介导恒温扩增（ 犔 犃 犕 犘） 检测方法 第部分： 产毒素霍乱弧菌 范围 的本部分规定了国境口岸检测疑似样本、 环境水等样品中产毒素霍乱弧菌的环介导恒 温扩增（ ） 法。 本部分适用于国境口岸产毒素霍乱弧菌的筛选检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（ 包括所有的修改单） 适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 实验室 生物安全通用要求 临床诊断中聚合酶链反应（ ） 技术的应用 霍乱诊断标准 缩略语 下列缩略语适用于本文件： ： 甜菜碱 犅 狊 狋酶犅 狊 狋 （ ） ：犅 狊 狋 聚合酶（ 大片段） （ ） ： 霍乱毒素 犮 狋 狓（ ） ： 霍乱毒素 亚单位基因 （ ） ： 脱氧核糖核酸 （ ） ： 脱氧核苷三磷酸 （ ） ： 乙二胺四乙酸 （ ） ： 环介导恒温扩增 ： 聚乙二醇辛基苯基醚 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全， 应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测产毒素霍乱弧菌， 所有培养物和废弃物应参照 中的有关规定执行。 防污染措施 防止污染措施应符合 的规定。 犛 犖犜 技术概要 根据产毒素霍乱弧菌的特异性序列基因设计特异性内引物、 外引物各一对， 或再增加环状引物一 对， 特异性识别靶序列上的独立区域， 利用犅 狊 狋酶启动循环链置换反应， 在特异性基因序列启动互补链 合成， 在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环 混合物； 从 析出 的焦磷酸根离子与反应溶液中的 结合， 产生副产物（ 焦磷酸镁） 形成乳白色沉淀， 可观查判断结 果； 另加入核酸显色液， 可观察颜色变化判定结果。 试剂和材料 除有特殊说明外， 所有实验用试剂均为分析纯； 实验用水符合 中一级水的要求。 引物： 根据产毒素霍乱弧菌属特有的靶序列犮 狋 狓 基因设计一套特异性引物， 包括外引物， 外引 物， 内引物， 内引物和环状引物， 环状引物。 外引物扩增片段长度： 。 外引物（ ， ） ： 外引物（ ， ） ： 内引物（ ， ） ： 内引物（ ， ） ： 环状引物（ ， ） ： 环状引物（ ， ） ： 提取液： 含 （ ） 、 和 。 ： 每种核苷酸浓度 。 犅 狊 狋 酶： 。 缓冲液： 含 （ ） 、 、 （） 、 、 。 ： 。 甜菜碱： 。 显色液： 浓度为 。 阳性对照： 可溯源的标准菌株， 或含目的片段的 亦可。 和 塑料离心管。 吸头， 配套移液器使用。 仪器和设备 移液器： 量程 ， 量程 ， 量程 。 高速台式离心机： 犵。 水浴锅或加热模块： 和 。 计时器。 检测程序 产毒素霍乱弧菌 检测程序见图。 犛 犖犜 图 产毒素霍乱弧菌犔 犃犕犘检测程序 操作步骤 样品制备、 增菌培养 按照 进行样品制备和增菌。 模板犇 犖 犃的制备 总则 参照 中 样品的处理中的原则制备检测模板， 可采用下述方法， 也可使用等效 的商品化 提取试剂盒， 并按其说明提取制备模板 。 阳性对照 犇 犖 犃制备 将产毒素霍乱弧菌标准菌株接种于 氯化钠碱性蛋白胨水（ ） 中 培养 ， 用无菌生理盐水稀释至约 （ 约麦氏浊度 ） ， 提取模板 作为 反应的模板。 前处理样本模板 犇 犖 犃的制备 对于 获得的处理后样本沉淀采用如下方法制备模板 ： 沉淀中加入 提取液， 混匀后沸水浴 ， 置冰上 ； 于 犵离心 ， 上清液即为模板 ； 取上清液置 犛 犖犜 可保存个月备用。 增菌液模板 犇 犖 犃的制备 取 获得的增菌液 加到 无菌离心管中， 犵离心 ， 尽量吸弃上清液， 再 按照 步骤制备模板 以待检测。 可疑菌落模板犇 犖 犃的制备 对于 分离到的可疑菌落， 可直接挑取可疑菌落， 再按照 步骤制备模板 以待 检测。 环介导恒温核酸扩增 反应体系 产毒素霍乱弧菌 反应体系见表。 表 产毒素霍乱弧菌犔 犃犕犘反应体系 组分工作液浓度 加样量 反应体系终浓度 缓冲液 外侧上游引物（ ） 外侧下游引物（ ） 内侧上游引物（ ） 内侧下游引物（ ） 环状上游引物（ ） 环状下游引物（ ） 甜菜碱 犅 狊 狋 聚合酶 模板 去离子水 反应过程 按照表所述配制反应体系； 恒温扩增 ， 使酶失活， 反应即结束。 空白对照、 阴性对照、 阳性对照设置 每次反应应设置阴性对照、 空白对照和阳性对照。 空白对照以无菌水代替 模板。 阴性对照以 提取液代替 模板。 犛 犖犜 结果观察 在上述反应管中加入显色液， 轻轻混匀并在黑色背景下观察。显色液优选为荧光染料 。 结果判定 在