《抗原的表达和纯化》PPT课件.ppt

抗原蛋白的表达和纯化,一、抗原组生产流程,Ag组的操作流程,可溶蛋白具体生产步骤,1、接种80ul菌种至100ml抗性培养基中，37度培养过夜。 2、次日加入新鲜抗性培养基至600ml，培养1.5小时至活力最旺盛。 3、加入0.5mM的IPTG诱导3.5小时 4、收集菌体（66转/秒15min),弃上清，加入PBST悬浮菌体，加入200ulMPMSF,100ul EDTA(his标签蛋白不加），冰浴下超声破碎细胞。 5、摇床4度孵育1小时。 6、高速离心，133转/秒15min。取上清，加入600ul beads结合过夜。 7、收集beads（33转/秒、瞬时），洗涤液洗涤3次。加入300ul洗脱液，4振荡洗脱1小时，瞬时离心，取上清。再次加入300ul洗脱液，洗脱1小时，两次洗脱液合为一管。 8、将所得的上清取10ul加入10ulsample buffer 制样，SDS-PAGE跑胶。 9、根据maker 的跑胶结果目测蛋白质量及浓度。,二、实验原理,基因的表达 亲和层析纯化可溶蛋白 包涵体的纯化原理 SDSPAGE电泳的基本原理,三、基因的表达,在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导。 如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏 。 原核生物的基因调控主要发生在转录水平上。原核生物的基因表达主要是负性调控，诱导物可用于去除阻遏作用。 公司构建的基因工程菌采用乳糖操纵子调控系统。,（一）乳糖操纵子(lac operon)的结构,（二）阻遏蛋白的负性调节,（三）CAP/CRP的正性调节,CAP (catabolite activator protein, 分解代谢物激活蛋白) 涉及到正性调节. CAP 又称为 CRP (cAMP receptor protein), lac operon高水平转录必需的一个激活蛋白。 葡萄糖抑制 cAMP的形成。葡萄糖存在时，cAMP浓度低；仅在葡萄糖消耗完毕时, cAMP浓度增高。,CAP结合位点,lacI-系统中，不管是否存在乳糖，三种乳糖分解代谢有关的酶得到持续表达。 lacI+系统中，当葡萄糖存在时，不表达三种酶；然而，当存在乳糖而又缺乏葡萄糖时，这三种酶得到表达。,乳糖操纵子受到两种调节：阻遏蛋白的负调节和CAP的正调节，有两道控制开关，只有两道开关同时打开时, 即只有在缺乏葡萄糖并存在乳糖时,基因才能够转录。,（四）乳糖操纵子诱导物,由于乳糖虽可诱导酶的合成，但易被-半乳糖苷酶催化降解，并且产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物诱导。乳糖操纵子的安慰诱导物除了异丙基巯基半乳糖（IPTG)，还可以是巯基半乳糖苷（TMG）、O-硝基半乳糖苷（ONPG)。 IPTG为常用的诱导物，是一种十分有效的乳糖操纵子的诱导剂,可与阻遏物结合促进基因的表达。IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被运送，不被大肠杆菌所分解所以浓度并不改变,（五）影响蛋白表达的因素,IPTG浓度：0.1-1mM 0.5mM 诱导温度:28 37 诱导时间:3.5h,四、亲和层析纯化可溶性蛋白,目前我们公司生产的抗原绝大部分是谷胱甘肽S-转移酶(GST) 融合蛋白和6X HIS Tag融合蛋白。 融合蛋白的优点有： (1)表达效率高； (2) 产生的融合蛋白比天然蛋白更稳定，融合蛋白是避免细菌蛋白酶降解的最好措施； (3) 产生的蛋白质易于鉴定，纯化。 GST-tag序列可以增加融合蛋白的溶解性。His-tag表达方便而且基 本不影响蛋白的活性,亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的蛋白的一类特殊层析技术。,（一）亲和层析技术原理,通常两个分子间特异亲和力的形成有两种情况： （1）两个分子之间，其构形有如积木般的互补，因为范德华力的关系，产生特异亲和力 （2）两分子之间，因为某些基团间产生了二级键，造成了吸引力。 亲和层析法按亲和配基的亲和力大小可分为两类（1）特异性配基亲和层析法，其配基，包括生物素、激素、抗原等，KD值为10-710-15。 （2）通用性配基亲和层析法，其配基包括天然配基、染料、氨基酸或肽、核酸、肝素、螯合金属离子等，KD值为10-410-6。,（二）亲和层析法分类,利用了GST与GSH间酶与底物构象互补的特异性结合特性，将带标签的蛋白与其他蛋白分离开。其结合力是范德华力，结合力弱且需较长的结合时间，但特异性高。 GST fusion protein的洗脱原理是通过调节GSH浓度及洗脱时间将目的蛋白洗脱下来,洗脱液中的还原型GSH与beads上的谷胱甘肽竞争结合融合蛋白，从而将目标蛋白洗脱。,（三） GST fusion protein的纯化 特异性配基亲和层析法,此图为Glutathione sepharose的终端结构，谷胱甘肽通过SH基团与sepharose基质的环氧乙烷基团通过环氧激活特异偶联到sepharose上。,此图为凝胶上的手臂谷胱甘肽与GST-tag融合蛋白结合后结构，中间红色的部分既为谷胱甘肽。,GST亲和纯化中常见的问题1,GST亲和纯化中常见的问题2,（四） 6X HIS Tag蛋白的纯化 特异性配基亲和层析法,蛋白质表面的一些氨基酸，例如组氨酸等能够与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+发生特殊的相互作用。因此偶联了合适金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性的吸附那些含有组氨酸的蛋白和对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。 beads与6x His fusion protein间产生了共价键，结合力强但特异性差。组氨酸残基的五元咪唑环是蛋白与Ni离子作用的关键 。,6x His fusion protein的洗脱原理是通过高浓度的咪唑洗脱目的蛋白，洗脱液中的咪唑通过和金属离子结合而高效地替换掉His标签