动物实验的基本技术和方法课件

动物实验的基本技术 和方法,上海中医药大学实验动物中心 汤家铭,进行实验操作前必须注意的事,1.动物福利和动物实验伦理问题 饲养繁殖实验动物的目的是用实验动物作为人类的替难者进行各种生物医学研究。一方面随着生物医学的发展，实验动物的使用量逐年增加，使用种类也逐年扩大；另一方面从动物福利和动物实验伦理学考虑，又需要减少一些不必要的动物实验，特别是人类的宠物诸如猫、犬、猴等，或者在不得不做的动物实验中尽可能将动物的痛苦、压迫和不适降到最低。,国际上对动物实验伦理有如下五项要求: 动物居住空间应符合标准,注意日常的饲育管理,不使动物陷入饥饿、缺水和患病。 尽可能地采用代替法最少地使用和牺牲动物。 在必须使用犬、猫和猴时，在实验前应进行训练，尽可能地减少动物的恐惧和不安。 实验结束和动物不可能恢复时，应采取安乐死。 要爱护动物和对由于实验死亡的动物应持有怜悯和感谢之情。,2. 动物实验技术和方法是实践性非常强的，不能仅靠书本理论知识，需要通过反复实践加以掌握。 目的： 保证实验的顺利进行。 减少动物承受的痛苦。,动物实验前的准备,1. 所用动物实验设施是否符合本实验要求 普通设施，SPF设施，感染性设施，有毒有害供试品设施，放射性设施 实验室、手术室 2. 所用实验动物的品种、品系、性别、数量等能否得到 所需要的动物实验技术是否熟练掌握 所用动物实验器具、试剂是否准备好,4. 兔抓取的注意点 最好戴人造革围裙和袖套，以免爪子抓伤。 采用正确地抓取方法。 可采用兔固定器固定进行实验操作，或一人抓取固定，一人实验操作。,5. 犬抓取注意点 实验用犬有专用的比格犬和农村收购来的草犬。 犬是通人性的，草犬购入后，饲养人员和实验人员要经常亲近它们，使它放松对你的警惕，容易直接抓取它们。 不要轻易使用长柄铁钳，钳伤造成的伤害会使它对你更加恐惧，影响以后实验的进行。 抓取后用绳子将嘴绑住。,二、动物编号常用的标记方法,适用需要个体识别的实验 染料标记法：适合白色被毛的动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔等。 黄色：常用35%苦味酸溶液 红色：常用0.5%中性红溶液 咖啡色: 2%硝酸银溶液 黑色：煤焦油酒精溶液 优点：简单、易识别 缺点：长期易退色；不能编大号码。,2. 剪耳（打孔）法：啮齿类小动物 3. 号码钳法：适用于兔、犬等大动物 4. 耳牌法：适用于羊、牛等大家畜 5. 电子芯片植入法：,三、动物被毛的去除方法,1. 剪毛法：用弯头剪逆毛方向剪 适用于各种实验动物 2. 拔毛法：常用于兔的耳缘静脉注射 3. 剃毛法：剃须刀、手术刀 适用于大动物 4. 脱毛法：脱毛剂,常用脱毛剂配方 配方1：硫化钠8g溶于100mL水中。 配方2：硫化钠：肥皂粉：淀粉的比例为3：1：7，再加水调成糊状。 配方3：硫化钠10g和生石灰15g溶于100mL水中。 配方1和2适用于家兔和啮齿类动物的脱毛，配方3适合给犬脱毛。 脱毛后用清水将脱毛区清洗干净。,四、实验动物的麻醉方法,对实验动物进行麻醉的目的是，消除实验过程中引起的痛苦和不适，确保实验动物的安全和动物实验的顺利进行，是动物实验伦理的一个重要方面。 应结合实验目的、实验动物种类、日龄及健康状况等因素进行综合考虑，决定选用的麻醉剂和麻醉方法。 麻醉方法有全身麻醉和局部麻醉两种。在实验动物的麻醉中绝大多数采用全身麻醉。,全身麻醉简称全麻，全麻是指麻醉药通过呼吸道吸入、静脉和肌肉注射等途径，进入实验动物体内，使其产生短时间意识丧失、痛觉消失、肌肉松弛和反射抑制等中枢神经系统抑制现象。当麻醉药从体内排出或在体内代谢破坏后，实验动物逐渐清醒，不留后遗症。 全麻有吸入麻醉法和注射麻醉法两种途径，吸入麻醉法用挥发性麻醉药，注射麻醉法用非挥发性麻醉药。,（1）吸入麻醉法 常用药物为乙醚等。吸入麻醉法有开放吸入和气管内插管吸入两种方法。动物实验大都采用开放吸入法 开放吸入：适用于啮齿类小动物，可用乙醚、氯仿 小动物吸入麻醉机国外已研制成功。 气管内插管：适用于犬、猴、羊等大动物，乙醚是最常用的麻醉药。 吸入麻醉的优点： 麻醉平稳、安全可靠、 停止吸入后很快苏醒 缺点： 需要一定的仪器设备，,吸入乙醚全麻的分期 第一期：镇痛期 指麻醉给药开始到实验动物意识完全丧失的时期。此期实验动物各种反射存在，肌张力正常，血压升高，心跳加快。 第二期：兴奋期 指实验动物从意识和感觉消失到外科麻醉期开始的时期。实验动物挣扎、屏气、瞳孔开大、眼球快速转动、血压明显升高、心跳明显加快、呼吸不规则、各种反射亢进。此期应频频取开面罩，让实验动物多次呼吸新鲜空气。 第三期：外科麻醉期 指实验动物由兴奋状态转入抑制状态的时期。实验动物的呼吸由不规则状态变为规则状态，血压和心率平稳、肌肉松弛、反射活动下降，此期是实验操作的最佳时期。 第四期：麻醉中毒期 指麻醉过深导致实验动物处于垂危状态的时期。此期出现的时间不定，主要表现为心跳和呼吸微弱、不规则甚至停止，血压急剧下降甚至测不到。如果抢救不及时会导致死亡。,（2）注射麻醉法 注射麻醉法是使用非挥发性麻醉药进行全麻的方法。在动物实验中比较常用。 常用麻醉药： 戊巴比妥钠 硫喷妥钠 氯氨酮 乌拉坦 大动物：静脉注射或腹腔注射 啮齿类动物：腹腔注射,实验动物麻醉应注意的事项 麻醉之前应禁食。 麻醉之前应准确称量动物体重，作为计算麻醉剂用量的依据。 应注意不同麻醉药对动物的作用是不同的，如戊巴比妥钠、硫贲妥钠等能抑制心肌收缩力，使肌肉松弛，而氯胺酮则相反。 大动物犬、猴、羊等麻醉前半小时应注射麻醉前给药如阿托品和苯巴比妥钠。 静脉注射麻醉药是必须缓慢，边注射边观察动物的意识、角膜反射、肌肉紧张性和对疼痛的反应，达到麻醉要求时应停止注射。,6.大动物手术时应配备麻醉师，在麻醉过程中密切观察动物的反应，如血压、脉搏、呼吸和体温，及时调节麻醉药剂量，保证手术顺利进行。 7.动物在麻醉期间、手术后至苏醒期体温会下降，应注意手术室的室温。 8. 注意术后护理。,麻醉意外的抢救 原因： 麻醉药速度过快、剂量过大、麻醉过深 后果： 中枢神经系统抑制导致呼吸系统、循环系统功能障碍，引起呼吸、心跳停止。 抢救方法： 要针对具体情况，采取对症治疗的措施。 1.立即停止供给麻醉剂 2.人工呼吸，吸氧 3.苏醒剂 4.呼吸中枢兴奋剂如可拉明等和心脏和呼吸兴奋剂，如0.1%肾上腺素适量作心内或静脉注射，静脉滴注50%葡萄糖溶液等。,五、实验动物的给药方法,经口给药法 注射法 其它途径给药方法 呼吸道给药 皮肤给药 脊髓腔内给药 脑内给药 直肠内给药 关节腔内给药,经口给药 拌入饲料、饮水中自由摄取 优点：省人力 缺点：因个体差异，摄入量不等 灌胃 优点：能准确定量 缺点：给动物造成一定的痛苦，需熟练掌握技术,大小鼠灌胃注意点 用灌胃针。 从嘴角处插入，到达咽部后改变灌胃针的方向，使其与食管的走向一致，然后顺利插入。 成年大鼠由于体型较大，不易保定。办法： 1）一人保定，一人灌胃 2）操作者抓取后，将大鼠尾部按在自己的胸部，达到固定尾部的目的，然后灌胃。,兔灌胃法 采用两人操作法。 操作者用左手拇指和中指挤压家兔两颊，将下颌挤开使兔被动张口，右手将开口器从一侧口角插入口腔并固定，用泡在水中的14号细导尿管，经开口器的孔插入，向前推进约15cm，可达胃内，确认泡在水中的导管另一端没有冒气泡，说明没有误入气管，即可注入药液。灌胃量为每只每次80-150mL。,1. 口服给药 用右手将口服药片夹在拇指和食指之间，把左手放在犬的圈套上，用拇指和食指压着犬的上唇，用力使犬的头向后仰，继而把右手中指放在犬的下颌向下压。当犬的嘴张大时，快速把药片放在舌根隆起的部位，合上犬的嘴，维持头后仰姿势，右手在咽喉部轻轻按摩。借助犬本能的吞咽动作服下药片。 2. 灌胃给药 在给犬灌胃时，将犬固定于特制的固定架上，实验时将木制开口器从一侧口角放入犬的口腔，用左手或绳子固定，右手持12号胃管由开口器的小圆孔向咽后壁方向不断插入，导管另一端置于一杯清水中，若连续出现气泡，说明插入呼吸道，应立即拔出胃管，重新操作。如无气泡，说明没有插入气管，插至约20cm，即可到达胃内。犬的灌药量为每只每次200-500mL。,犬的经口给药法,各种动物一次灌胃能耐受的最大容积,注射法 注射法有皮下注射、腹腔注射、静脉注射、肌肉注射以及皮内注射、脑内注射等。 药物吸收速度： 静脉注射腹腔注射肌肉注射 皮下注射。 皮内注射常用于观察皮肤血管通透性变化或反应，如过敏试验 脑内注射常用于病毒学接种,静脉注射 大小鼠尾静脉注射 大鼠、沙鼠、豚鼠后肢浅背侧足中静脉注射 兔耳缘静脉注射 4. 犬前肢头静脉和后肢小隐静脉注射,尾静脉,其它途径给药方法 呼吸道给药： 皮肤给药： 脊髓腔内给药： 4. 脑内给药： 5. 直肠内给药： 6. 关节腔内给药：,（一）采血法 大小鼠 剪尾 尾静脉切割 大鼠后肢足中静脉采血 眼眶后静脉丛采血 摘眼球采血 腋窝动静脉采血 心脏采血 腹主动脉采血,六、实验动物体液的采集方法,大小鼠心脏采血,眼眶后静脉从采血,尾静脉切割采血,一个动物到底能采多少血，取决于动物的体重、定期活体采血还是处死采血。 动物的全血量为动物体重的8%左右，其中约30%储藏在全身毛细血管内。全血中约50%是有形成分。据此可测算处死后的采血量和血清量。 采血为全血量的10%时，两个星期恢复； 采血为全血量的30%时，将危及生命。,大小鼠不同采血方法的比较,豚鼠 1. 豚鼠心脏采血 兔 兔耳缘静脉采血 兔颈动脉采血 犬 犬前肢头静脉采血 犬后肢外侧小隐静脉采血,各种实验动物活体安全采血量和致死采血量,（二）采尿法 反射排尿法 代谢笼法 导尿法 膀胱穿刺法,七、实验动物常用处死方法,安死术的概念 “安死术”是指以人道的方法处死动物的过程。在处死动物过程中减少动物的惊恐或焦虑，安静地、无痛苦地死亡。,采用安死术必须符合的标准 死亡时没有惊恐、疼痛的表现 使其在最短时间内失去意识，迅速死亡 方法可靠且可重复 对操作人员安全 采用的方法要与研究要求和目的一致 对观察者和操作者的情绪影响最小 对环境污染的影响最小 设备简单、价廉、易操作 处死动物地点应远离，并与动物室隔开,大鼠小鼠 1.脊椎脱臼法 2.急性失血法 3.麻醉致死法 4.气体窒息致死法,猫、犬、兔 1.空气栓塞法 优点： 方法简单、迅速， 缺点：由于动物死于急性循环衰竭，各脏器凝血十分明显。 2.急性失血法 先行麻醉，再分离颈动脉或股动脉，将一根较粗的塑料管插入动脉内放血。动物在35min内即可死亡。 优点： 动物十分安静，对脏器无损伤，对活杀采集病理切片标本是一种比较好的方法。 3.化