《细菌生理检查法》PPT课件.ppt

第二章 细菌生理学检查法,第一节 细菌的培养 一、培养基及种类 二、细菌培养的条件 三、细菌的接种与培养 第二节 常用培养基的制备 一、生化试验培养基和试剂 二、一般培养基和专用培养基,一、培养基及种类,根据培养基的用途来区分： (1)通用培养基：培养异氧细菌最常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基；配制适合于厌氧菌生长的培养基时，通常须在培养基中加入适量的还原剂如巯基醋酸钠、维生素C或半胱氨酸来降低培养基的氧化还原电位，以利于厌氧菌的生长。 (2)鉴别培养基：是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌落的培养基。(伊红美蓝琼脂、乳糖胆盐发酵培养基、亚硫酸铋琼脂、微生物快速显色培养基） (3)选择性培养基：根据某微生物的特殊营养要求或对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌。（马丁氏培养基、Ashby无氮培养基） 有些培养基是具有选择和鉴别双重作用。例如食品检验中常用的麦康凯培养基是一例。它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）。,根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分： ）天然培养基 天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以较为常用，尤其适合于配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。 ）合成培养基 合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。 ）半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。,根据培养基的物理状态来区分： ）液体培养基 所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。 ）固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。 ）半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.21%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。,培养基制备技术 培养基制备的基本方法和注意事项,培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长; 因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。 培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内:液体分装至试管1/4左右 为宜；如固体则分装量为管高的1/5；半固体培养基，则分装至试管的1/21/3为宜；锥形瓶分装培养基时，容量应不超过容积的一半为宜；9cm的培养皿可倒入15ml培养基。 一般培养基可采用121C高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50C左右的培养基中。,灭菌和消毒,消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法， 灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态。,灭菌和消毒 物理方法,温度 ：利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用，低温通常起抑菌作用。 a.灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌。 b.干热空气灭菌法：这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160C，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。 附：电热恒温干燥箱（俗称“烤箱”）的使用 把待灭菌的物品均匀地放入烤箱中，关上箱门，调节温度至160C，打开电源，待温度上升至160C时计时，维持该温度0.5-1小时。注意：多观察几次温度，防止温度失控。用量较少的实验室可以做几个铁皮筒，盖子侧面带孔，灭菌时将孔打开，灭菌冷却过后将孔关闭。可以将吸管每支单独用白纸包裹用脱水粘上（防止纸散开来），装入铁皮筒灭菌，使用时可以单独拿，避免污染其它吸管。玻璃皿也可以单独用白纸包裹用脱水粘上，装入铁皮筒灭菌。无菌瓶可以盖上盖子，用用白纸包起盖子，用棉线扎起来，不可以用尼龙线，因为尼龙线不耐高温，易断。,灭菌和消毒 物理方法,湿热灭菌法:在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。 a.巴氏消毒法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62C，30分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。 b.煮沸消毒法：直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌的全部营养和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸钠或2%的石炭酸，则效果更好。此法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。 c.间歇灭菌法：上述两种方法在常压下，只能起到消毒作用，而很难做到完全无菌。若采用间歇灭菌的方法，就能杀灭物品中所有的微生物。具体做法是：将待灭菌的物品加热至100C，1530分钟，杀死其中的营养体。然后冷却，放入37C恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体。第2天再重复上述步骤，三次左右，就可达到灭菌的目的。此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦，所需时间长。,灭菌和消毒 物理方法,d. 加压蒸汽灭菌法：把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055公斤/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121C。在这种情况下，微生物（包括芽孢）在1520分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。 在加压蒸汽灭菌中，要引起注意的一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷空气，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这样会大大降低灭菌效果。 附：高压锅的使用 打开锅盖，取出内锅，观察水量，补充水量至比墩子略高，将需灭菌的物品放入内锅，盖 上盖子，对称旋紧螺栓，关闭放气阀，打开电源，待压力表上指针指向0.05时打开放气阀放冷气，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀，待压力表上指针指向0.05时再次打开 放气阀放冷气，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀；冷气放完后，待压力表上指针指向 0.10时打开放气阀，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀，反复放气2-3次，最后拨下电 源，不打开放气阀，让其自然冷却。取物品时一定要将放气阀打开，等到压力表上指针指 向0时方可对称旋松螺栓，打开盖子取出物品。,灭菌和消毒 物理方法,影响灭菌的因素 a.不同的微生物或同种微生物的不同菌龄对高温的敏感性不同。多数微生物的营养体和病毒在5065C，10分钟就会被杀死；但各种孢子、特别是芽孢最能抗热，其中抗热性最强的是嗜热脂肪芽孢杆菌，要在121C，12分钟才被杀死。对同种微生物来讲，幼龄菌比老龄菌对热更敏感; b.微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数量越多，热死时间越长; c.培养基的成分与组成也会影响灭菌效果。一般地讲，蛋白质、糖或脂肪存在，则提高抗热性，pH在7附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热能力下降，而不同的盐类可能对灭菌产生不同的影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。 灭菌对培养基成分的影响 a.pH值普遍下降; b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2与PO4-3化合，就会产生磷酸钙沉淀; c.不少培养基颜色加深; d.体积和浓度有所变化; e.营养成分有时受到破坏。,灭菌和消毒 物理方法,辐射：利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广，目前主要应用在以下几个方面： ）接种室、手术室、食品、药物包装室常应用紫外线杀菌。 ）应用射线作食品表面杀菌，射线用于食品内部杀菌。经辐射后的食品，因大量微生物被杀灭，再用冷冻保藏，可使保存期延长。 过滤：采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而达到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给实验带来一定的麻烦。,灭菌和消毒 化学方法,一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中的病原微生物，所以是起消毒剂的作用，而不是灭菌剂。 能迅速杀灭病原微生物的药物，称为消毒剂。能抑制或阻止微生物生长繁殖的药物，称为防腐剂。但是一种化学药物是杀菌还是抑菌，常不易严格区分。消毒剂在低浓度时也能杀菌（如1：1000硫柳汞）。由于消毒防腐剂没有选择性，因此对一切活细胞都有毒性，不仅能杀死或抑制病原微生物，而且对人体组织细胞也有损伤作用，所以只能用于体表、器械、排泄物和周围环境的消毒。常用的化学消毒剂有：石碳酸、来苏水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。,微生物的分离、纯化与接种技术,接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的 不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作 为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。 接种和分离工具 1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,微生物的分离、纯化与接种技术,划线接种： 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。,划线接种，分离纯化,Inoculating an agar plate to obtain single colonies,灼烧,微生物的分离、纯化与接种技术,斜面接种技术,微生物的分离、纯化与接种技术 细菌的涂布分离技术,微生物的分离、纯化与接种技术 液体接种法、穿刺接种,液体接种法：包括从斜面菌种接入培养液，或从液体菌种接入液体培养液，两种情况都可以用接种环接种。但在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种，同时要求无菌操作。,微生物的培养 微生物培养中的氧气条件,培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵摇床、厌氧培养罐等。 好氧培养：例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。 厌氧培养：除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、化学或生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧气，创造厌氧条件。对于严格厌氧的微生物，要用化学和物理并用的方法。在进行厌氧培养时，可以用指示剂检查系统中的还原条件，一般实验室中常用的如葡萄糖美兰指示剂。,微生物的培养 微生物培养中的厌氧条件,生物学方法：利用植物呼吸作用，造成厌氧条件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入发芽种子，因种子的呼吸作用增强，吸收氧气，创造厌氧条件。此法简易，但厌氧程度低。 化学方法：利用焦性没食子酸吸收容器中的氧气。在容器的一边放一包用吸水紙包好的焦性没食子酸，在另一边放入碱液，容器密封后，让碱液流向焦性没食子酸一边，两者反应时吸收容器中的氧气，创造厌氧条件。 物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器内的空气或再充入其它惰性气体，以保证厌氧条件。抽气前，容器内放入指示剂和培养物。一般为达到严格厌氧目的，常采用物理和化学相结合并用的方法。,微生物的培养 微生物培养中的厌氧培养,美兰氧化还原指示剂：0.006N NaOH 0.015% 美兰溶液 6 葡萄糖溶液 上列三种溶液在使用时等量混合，加热使美兰退色，迅速放入厌氧罐中。,微生物的分离、纯化与接种技术 液体接种法、穿刺接种,液体接种法：包括从斜面菌种接入培养液，或从液体菌种接入液体培养液，两种情况都可以用接种环接种。但在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种，同时要求无菌操作。,微生物的培养 微生物培养中的氧气条件,培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵摇床、厌氧培养罐等。 好氧培养：例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。 厌氧培养：除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、化学或生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧气，创造厌氧条件。对于严格厌氧的微生物，要用化学和物理并用的方法。在进行厌氧培养时，可以用指示剂检查系统中的还原条件，一般实验室中常用的如葡萄糖美兰指示剂。,微生物的培养 微生物培养中的厌氧条件,生物学方法：利用植物呼吸作用，造成厌氧条件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入发芽种子，因种子的呼吸作用增强，吸收氧气，创造厌氧条件。此法简易，但厌氧程度低。 化学方法：利用焦性没食子酸吸收容器中的氧气。在容器的一边放一包用吸水紙包好的焦性没食子酸，在另一边放入碱液，容器密封后，让碱液流向焦性没食子酸一边，两者反应时吸收容器中的氧气，创造厌氧条件。 物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器内的空气或再充入其它惰性气体，以保证厌氧条件。抽气前，容器内放入指示剂和培养物。一般为达到严格厌氧目的，常采用物理和化学相结合并用的方法。,微生物的培养 微生物培养中的厌氧培养,美兰氧化还原指示剂：0.006N NaOH 0.015% 美兰溶液 6 葡萄糖溶液 上列三种溶液在使用时等量混合，加热使美兰退色，迅速放入厌氧罐中。,微生物细胞大小和数量的测定,目的要求：学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显微镜下测定微生物大小的方法；学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。 实验材料：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、细菌染色片、血球记数板、酵母菌悬液、盖玻片、无菌滴管、西水纸、擦镜纸、香柏油、二甲苯,测定微生物的大小,测定的工具：目镜测微尺 镜台测微尺,测定微生物的大小,目镜测微尺的校正：在高倍镜下，看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使目镜测微尺的0点与镜台测微尺的某一刻度重合，然后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。计算两刻度间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。由于镜台测微尺的刻度每格长10m，所以可得： 目镜测微尺每格长度（m）=（镜台测微尺格数10）/目镜测微尺格数 注意：校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的接物镜、接目镜、镜筒长度等）进行，而且只能在这特定的情况下才可重复使用。 菌体大小的测定：取下镜台测微尺，将细菌染色标本置于载物台上，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的长和宽。,测定微生物数量,方法：活菌计数法平板菌落计数法；总菌计数法血球计数板或霍瑟（Peroff Hausser）细菌计数板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。,测定微生物数量,本实验用血球计数板计数酵母菌的数量 取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。 取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。 静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央。 高倍镜下计数：随机计数五个中格的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。 计算方法： 注意事项：压在方格线上的菌体，以压在底线和右侧线上的菌体计入本格内；遇到有芽体的酵母时，若芽体和母体同等大，就按单个酵母计数。 计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。,细菌生理学检查法 微生物保藏方法,斜面冰箱保藏法：将菌种接在新鲜斜面培养基上，定温培养长出丰满菌苔后，一般形成芽孢的细菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要长出孢子，贴上标签，放在试管架上，在棉塞部位用尼龙紙或防水紙包好，放入40C冰箱中保藏。一般每隔3个月至半年用新鲜培养基移植1次。方法简便，实验室均采用。 缺点：移接代数太多，易产生变异、退化。 石蜡封藏法：在已长好的斜面菌种上加入无菌液体石蜡油，高出斜面1cm直立试管放入冰箱保藏，适用保存细菌和放线菌。 石蜡的处理：250mL三角瓶装100mL液体石蜡，1.05kg/cm3高压灭菌30min，然后放在1050C左右的烘箱中1h，使水分蒸发掉。 砂土管保藏法：(可用于保藏产孢子的放线菌、霉菌和产芽孢的细菌）。 1.砂土管的制备：取河沙若干，用40目过筛，出去大颗粒，加10HCl后煮沸30min，除去有机质（也可用10HCl浸泡24h)。最后倒去酸水，用自来水冲洗至中性，烘干备用。另取0.3m以下非耕作层的瘦黄土若干，晒干磨细，过120目筛。 2.按 土：砂1：4 的比例均匀混合，装入指形管中，以1cm高为宜，塞上棉塞，1601700C干热灭菌2h。 3.在新鲜菌种斜面上加入3mL左右的无菌水，用无菌接种环制成菌悬液，用无菌吸管吸取0.20.3mL的菌悬液放入每个砂土管中，用接种环拌匀，并贴上标签，注明菌名。 4.菌液加好后，立即进行抽真空干燥，要求在24h内抽干，尤其是夏天要求较短时间内抽干。摇散砂土，放干燥器内冰箱保藏。 冷冻真空干燥保藏法：此法一般常用于细菌或病毒一类的菌种保藏，常用脱脂牛奶或血清作为菌种的保护剂。,细菌生理学检查法 微生物生化反应,生化反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。,糖酵解试验 淀粉水解试验 V-