《蛋白质共价结构》PPT课件.ppt

第4章 蛋白质的共价结构,1 蛋白质通论,1.1 形状和大小 按形状和溶解度分类： 纤维状蛋白质：角蛋白、丝蛋白、胶原蛋白 不溶于水和稀盐溶液；结构作用。 球状蛋白质： 溶解性较好；功能多样。 相对分子质量：6000到1x106,1.2 构象和组织层次,构型：具有相同结构式的立体异构体中取代基在空间的相对取向。 不同的构型间的转变需要共价键的断裂和重新形成。 构象：具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能的多种状态。 不同的构象间转变不需要共价键的断裂和重新形成。,蛋白质的天然构象：每一种蛋白质至少有一种构象在生理条件下是稳定的，并具有生物活性的构象。,结构层次： 一级结构 （1） （primary structure) 二级结构 （2） （secondary structure） 超二级结构 （supersecondary structure） 结构域 （structural domain） 三级结构 （3） （tertiary structure） 四级结构 （4） （quarternary structure）,各个结构层次之间的关系可以作下列表示： 一级结构二级结构超二级结构 结构域三级结构四级结构,1.3 蛋白质功能的多样性,催化 (酶) 调节 (激素、激活剂） 转运 （血红蛋白、膜转运蛋白） 贮存 （卵清蛋白） 运动 （肌动蛋白、肌球蛋白） 结构成分 （角蛋白、胶原蛋白） 防御和进攻 （免疫球蛋白、蛇毒的溶血蛋白）,P161-162,荧光素酶,血红蛋白（氧转运蛋白）,角蛋白,2 蛋白质的一级结构,一级结构 （primary structure): 多肽链的氨基酸的序列。 主要连接键：肽键,肽链中的氨基酸由于形成肽键时脱水，已不是完整的氨基酸，所以称为残基,2.1 肽键和肽,肽键：反式构型,二肽 三肽 四肽,寡肽（oligopeptide） 12个以上，20个以下氨基酸缩合而成,多肽（Polypeptide） 20个以上氨基酸缩合而成,肽（peptide） ：由两个或两个以上的氨基酸通过肽键连接而形成的化合物。,肽链：氨基酸通过肽键连接起来而形成的链。,肽单位,肽链书写方式：从左到右，N端C端,命名：根据氨基酸组成，由N端C端命名为 某氨酰某氨酰某氨基酸,丙氨酰谷氨酰甘氨酰赖氨酸 AlaGlu-GlyLys (or AEGK),2.2 肽的化学性质 双缩脲反应：肽和蛋白质特有的。 含有两个或两个以上的肽键化合物与CuSO4碱性溶液生成紫红色或蓝紫色的复合物。 用分光光度计测定蛋白质含量。,2.3 天然存在的活性肽,活性肽（active peptide）: 有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在，通常都具有特殊的生理功能。, 多肽激素, 多肽抗菌素,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽) 由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Met-脑啡肽,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Leu-脑啡肽, 脑啡肽,与真核生物的RNA聚合酶和牢固结合, 鹅膏蕈碱,CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH,CH2,CH2,CHNH2,COOH,CH2,SH, 谷胱甘肽,3 蛋白质一级结构的测定, 测定蛋白质分子中多肽链的数目 拆分蛋白质的多肽链 断开多肽链内的二硫桥 分析每一多肽链的氨基酸组成 鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基 裂解多肽链成较小的片段 测定个肽段的氨基酸序列 重建完整多肽链的一级结构 确定半胱氨酸残基间形成的S-S交联桥位置,Sanger于1953年第一个测定氨基酸序列 -牛胰岛素（insulin） (获1958年诺贝尔化学奖) DNFB(2,4-二硝基氟苯) N末端,21,30,蛋白质的N-末端或C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量,3.1 测定蛋白质分子中多肽链数目,3.2 拆分蛋白质的多肽链和断开多肽链内的二硫桥,非共价键： 血红蛋白（四聚体） 断裂：8mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍 二硫键：链内或链间 还原：过量的- 巯基乙醇（pH89） 保护巯基：烷基化试剂（碘乙酸）,水解破坏肽健,（主要是酸水解，同时辅以碱水解 ）,3.3 氨基酸组成的分析,氨基酸组成： 用每摩尔蛋白质中含有氨基酸残基的摩尔数， 或每100g蛋白质中含有氨基酸的克数来表示。,3.4 N末端和C末端氨基酸残基的鉴定,(1) N末端 2，4-二硝基氟苯（DNFB)法* 丹磺酰氯（DNS)法 苯异硫氰酸酯（PITC)法* 氨肽酶法, 2，4-二硝基氟苯（DNFB)法,DNFB,DNP-蛋白质,DNP-氨基酸, 丹磺酰氯法（DNS法）,原理与DNFB法相同,丹磺酰基有强荧光，灵敏度 比DNFB法高100倍,水解后DNS-氨基酸不需提取 直接用层析鉴定。,(DNS-氨基酸), 苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、Edman降解法 ）,特点：剩下的肽链仍是完整的。,每次只从蛋白质的N端解离和鉴定一个aa残基,还可用来测定氨基酸序列, 氨肽酶法,肽链外切酶，从肽链N-末端逐个降解，释放出游离氨基酸。,局限性：酶对各种肽键敏感性不一样，常常难以判断氨基酸残基的顺序。,(2) C末端 还原法 肼解法 羧肽酶法, 硼氢化锂还原法, 肼解法,多肽与肼在无水条件下加热，可断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用层析鉴定。, 羧肽酶法,肽链外切酶，从肽链C-末端逐个降解，释放出游离氨基酸。,3.5 多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化, 酶裂解法*：（酶的专一性） A 胰蛋白酶( Trypsin）： R1=赖氨酸、精氨酸 但R2=脯氨酸 抑制 B 胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）： R1=苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸 但R2=脯氨酸 抑制 C 嗜热蛋白酶： R2=亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸 D 胃蛋白酶: R1和R2=苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸,溴化氰（CNBr）:只断裂Met的羧基形成的肽健, 化学裂解法：,3.6 肽段氨基酸序列的测定,肽部分水解后，降解成长短不一的小肽段，用层析或电泳分离，然后测序。 Edman化学降解法（PITC） 1950年Edman P.首先提出 多肽的游离末端NH2+ PITC PTC-多肽 (PTC-氨基酸) （环化）PTH -氨基酸+减少一个残基的肽, 根据核苷酸序列的推定法,多用两种水解方法降解，得到两套肽段，经两套肽段序列的重叠拼接得到整个肽链全长序列。,3.7 肽段在多肽链中次序的决定,氨基末端残基 H 羧基末端残基 S,第一套肽段 OUS PS EOVE RLA HOWT,第二套肽段 SEO WTOU VERL APS HO,末端残基 H S 末端肽段 HOWT APS,HOWT,HO,WTOU,OUS,SEO,EOVE,VERL,RLA,APS,PS,溴化氰,胰蛋白酶,DNFB,38,N:(E) Glu,断开二硫键,K：Lys,R：Arg,M：Met,C:(D)Asp,3.8 二硫桥位置的确定 胃蛋白酶水解 (专一性低，切点多；作用pH（2）防止二硫键发生交换反应） Brown及Hartlay的对角线电泳技术 （过甲酸断裂二硫键）,对角线电泳,4 蛋白质的氨基酸序列与生物功能,同源蛋白质的物种差异与生物进化 同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。 氨基酸序列同源 ，如血红蛋白。 不变残基、可变残基 细胞色素c：含血红素的电子转运蛋白。 存在于所有真核生物的线粒体中。28个不变残基。,两个物种的同源蛋白质的序列间的氨基酸差异数目与这些物种间系统发生差异是成比例的。 细胞色素c 人与黑猩猩0； 人与其他哺乳动物10； 人与酵母40以上。,系统树：分析细胞色素c序列并找出连接分支的最小突变残基数的方法。,5 肽和蛋白质的人工合成,1958年，北京大学生物系在国内首次合成具有生物活性的八肽-催产素。 1965年9月，中国科学院生物化学研究所、有机化学研究所和北京大学化学系协作，在世界上首次人工合成了结晶牛胰岛素。,肽的人工合成,液相合成法 N端C端 氨基和羧基保护剂及激活剂 固相肽合成,液相合成法,（1）一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基被保护基封闭,羧基保护基(Z)：甲酯（CH3O-）、乙酯（C2H5O- ） 在室温下皂化除去,保护基：接肽时起保护作用， 接肽后容易除去，又不引起肽健断裂。,氨基保护基(Y)：苄氧甲酰基（Cbz） 可用催化加氢或用金属钠在液氨中处理除去,（2）在缩合剂作用下缩合形成二肽 (肽键不能自发形成),缩合剂：N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）,（3）接肽完成后除去保护基,缺点：步骤多，产率低, 固相肽合成,（1）第一个氨基酸(N端被保护)的羧基端先和(氯甲基聚苯乙烯)树脂反应，形成苄酯。,（3）第二个氨基酸（氨基预先用叔丁氧甲酰基保护）,以DCC为缩合剂，接在第一个氨基酸的氨基上。重复这个方法。,（4）最后使多肽与树脂分离，同时除去保护基。,（2）除去该氨基酸N端的保护基,固相肽合成,挂接,去保护,活化羧基,氨基保护,缩合,断裂与去保护,Exercise,由下列信息求八肽的序列。 （a）酸水解得 Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val； （b）Sanger试剂处理得DNP-Ala； （c）胰蛋白酶处理得Ala，Arg，Thr 和 Leu，Met，Phe，2Val，当以Sanger试剂处理时分别得到DNP-Ala和DNP-Val； （d）溴化氰处理得 Ala，Arg，高丝氨酸内酯，Thr，2Val，和 Leu，Phe，当用Sanger试剂处理时，分别得DNP-Ala和DNP-Leu。,答： （1）酸水解得 Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val； 可知氨基酸的种类和数量 （2） Sanger试剂处理得DNP-Ala 由于Sanger试剂(DNFB)反应可鉴定N末端氨基酸残基，所以Ala 位于此八肽的N端。 N末端:Ala,(3)胰蛋白酶处理以Sanger试剂处理, 胰蛋白酶：水解Lys和Arg的羧基形成的肽健 Ala，Arg ， Thr 和 DNP-Ala N末端:Ala 三肽顺序为Ala-Thr-Arg Leu，Met，Phe，2Val，和DNP-Val N末端:Val Ala-Thr-Arg Val,(4) 溴化氰处理Sanger试剂处理 由于溴化氰（CNBr）断裂Met的羧基形成的肽健 Ala，Arg，高丝氨酸内酯，Thr，2Val和 DNP-Ala N末端:AlaMet L