联合应用成骨诱导后骨髓间充质干细胞与PLGA支架材料修复兔桡骨缺损的实验研究.doc

联合应用成骨诱导后骨髓间充质干细胞与PLGA支架材料修复兔桡骨缺损的实验研究 作者：王岩松，刘丹平，梅晰凡【摘要】 目的 研究聚乳酸聚乙醇酸复合物(Po(yclactic-co-glycolic acid),PLGA)支架作为组织工程骨支架修复骨缺损的可行性。方法 体外培养兔骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)，在成骨诱导剂地塞米松等的诱导下，向成骨细胞转化，并使之与修饰后PLGA支架复合，植入兔桡骨缺损模型，作为实验组。对照组a为PLGA材料对照，对照组b为空白对照，通过影像学观察骨缺损的修复情况。结果 地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化，碱性磷酸酶表达明显增高，并表达型胶原。应用多聚赖氨酸修饰的PLGA与成骨诱导的BMSCs复合植入骨缺损后，与对照组相比影像学显示明显促进骨缺损的愈合。结论 适当浓度成骨诱导剂可成功的将兔骨髓间充质细胞向成骨细胞诱导，诱导后细胞与PLGA支架联合应用可较好修复兔桡骨缺损。 【关键词】 骨髓间充质细胞;成骨诱导;PLGA载体 Abstract: Objective To investigate the feasibility of PLGA as scaffold material in bone tissue engineering. Methods The purified bone marrow stromal cells which were separated from rabbit were induced into osteoblasts by Dexamethasone, -glycerophophate and Vitamin C and co-cultured with modified PLGA in vitro，then implanted them into the defects of rabbits as the experiment group，in the control group A, only PLGA was implanted，in control group B, nothing was implanted. The results were evaluated by radiograph. Results The form of the induced cells by Dexamethasone was converted to like-osteoblasts, the expression of ALP increased noticeably，and the expression of Collagen I was observed. In the experiment group, 12 weeks after the operation, the defect was repaired by newly-formed callus. In the two control groups, after 12 weeks no callus formed and the defects were not repaired. Conclusions Rabbit bone marrow stromal cells can be induced into marrow stromal osteoblasts by suitable contents of dexamethasone. Modified PLGA is a good scaffold material for the bone tissue engineering.Key words: bone marrow stromal cells;osteoblasts induction; Poly (lactic-co-glycolic acid)骨缺损修复一直是骨科临床面临的一大难题，组织工程骨再造被认为是最有前景的骨缺损治疗修复方法之一。组织工程化骨构建首先需要适合的种子细胞，在一定诱导条件下，可使BMSCs向成骨细胞分化的数目大大增加1,2，且取材方便，是良好的骨组织工程种子细胞。PLGA作为迄今研究、应用最多的一种生物可降解合成材料，广泛运用于骨、软骨、血管、神经、皮肤等组织，并已获得美国FDA的批准用于临床，显示出良好的应用前景3,4。PLGA具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性等优点并可精确地控制其分子量、降解时间及孔隙率和孔径等性能。该材料也存在一定的缺点，如疏水性强，与细胞的亲和性差，不利于种子细胞在支架上的黏附等，从而影响组织工程化骨组织构建的成功率。如果采取一定的改良修饰，如应用多聚赖氨酸，胶原等，可使其亲和性改善，满足骨组织工程支架的要求。本实验体外培养兔骨髓间充质干细胞，在成骨诱导剂的诱导下，向成骨细胞转化，并将其作为种子细胞，PLGA为支架材料，植入兔桡骨缺损模型，观察对骨缺损的修复情况。1 实验材料和方法1.1 实验材料与试剂1.1.1 实验材料 96 孔培养板和24 孔培养板,胎牛血清,胰蛋白酶，TritonX-100,地塞米松，维生素C, -甘油磷酸钠，碱性磷酸酶试剂盒，多聚赖氨酸，PLGA载体，I型胶原原位杂交试剂盒。1.1.2 实验动物 1.5 月龄健康新西兰大耳白兔27只(由锦州医学院实验动物中心提供，动物质量许可证号：SYXK(辽)2003-0011)，体重2 kg。1.1.3 实验仪器 倒置相差显微镜 , AT-858自动酶标分析仪，CO2 培养箱，超净工作台，X光机。1.2 实验方法1.2.1 兔骨髓间质干细胞的分离和培养5 无菌条件下分离培养兔骨髓间质干细胞。1.2.2 兔骨髓间质干细胞的成骨诱导及鉴定 细胞传至第3代后，进行成骨诱导 ,实验分诱导组和非诱导组，诱导液为10-8mol/L地塞米松,10 mmol/L -甘油磷酸钠和50 mg/L维生素C, 倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，分别在适当的时间测定碱性磷酸酶含量、型胶原的表达情况、Vonkossa染色。碱性磷酸酶含量测量 0.25%胰蛋白酶消化细胞后，细胞计数，以2 000 个/孔的密度接种于5 块96 孔培养板上。实验分2 组：诱导组和非诱导组;每组10 孔，每3 天换液，于第4天、6天、8天、10天、12天分别取出1 块培养板，经0.5% TritonX-100处理后，4 冰箱过夜，用酶标分析仪测碱性磷酸酶含量。型胶原的表达检测 0.25%胰蛋白酶消化细胞后，细胞计数，以1104个/孔的密度接种于24 孔培养板。培养板内置预先经多聚赖氨酸防脱片处理的盖玻片，每3 天换液。实验分组同前，于第15 天应用原位杂交技术检测各组型胶原的表达情况。钙结节Vonkossa染色 诱导15 d后取出细胞爬片，PBS清洗3 次，2% AgNO3水溶液浸染，紫外线下处理30 min，蒸馏水洗1 min，5%硫代硫酸钠水溶液处理2 min后自来水洗5 min。1.2.3 诱导后细胞与PLGA支架材料复合体构建 将PLGA载体环氧乙烷消毒，扫描电镜观察。将载体分别置于24 孔培养板中。先后应用无水酒精处理48 min，三蒸水处理36 min, 12 min换水1 次。使材料充分湿化。每孔分别加入多聚赖氨酸将材料充分浸泡2 min，吸除多余液体，细胞培养箱内干燥，将传了3 代的成骨诱导的BMSCs制成浓度为4106个/ mL细胞悬液,接种到装有载体的24 孔培养板中,移入CO2细胞箱培养4 min后,在支架周围小心加入培养液,进行培养。培养24小时后取出载体，植入兔桡骨缺损模型。1.2.4 兔桡骨骨缺损模型的建立及实验分组 选用新西兰大白兔27只,随机分为3组。按无菌操作技术行左侧桡骨中上段截骨,造成15 mm骨和骨膜缺损。实验组:骨缺损植入成骨诱导的自体骨髓基质干细胞/PLGA复合支架。对照a组: 单纯植入PLGA复合支架。对照b组：骨缺损对照组。创口严密缝合,不做内、外固定，分笼喂养,自由活动，肌肉注射庆大霉素，术后第12 周行术侧尺桡骨的正位X线片检查。1.2.5 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件进行处理分析，实验数据用s表示，组间比较均采用重复测量的方差分析。2 结 果2.1 兔骨髓间质干细胞成骨诱导后形态观察 诱导后细胞自第3天可见部分细胞由长梭形逐渐变成长方形，并逐渐变为多角形，体积较诱导前增大，多角形细胞比例随着培养时间的延长而逐渐增高,见图1。2.2 兔骨髓间质干细胞的成骨诱导鉴定2.2.1 各组碱性磷酸酶活性检测结果 非诱导组碱性磷酸酶有基础表达，但表达量低，随时间略有增加;地塞米松等诱导组第4天时碱性磷酸酶表达与非诱导组无明显差别,随后碱性磷酸酶表达开始随时间的延长而逐渐升高，P<0.05,具有显著性差异。表1 成骨诱导组兔骨髓间充质细胞与非诱导组在不同时间点的ALP比较*成骨诱导组与未诱导组比较，P<0.05,具有显著性差异2.2.2 各组原位杂交技术检测型胶原结果 成骨诱导组检测型胶原结果发现胞浆内可见大量棕黄色颗粒，见图2。非诱导组结果为阴性。2.2.3 钙结节Vonkossa染色结果 成骨诱导组Vonkossa染色可见钙盐沉积区域呈黑色钙结节，见图3。非诱导组结果为阴性。2.3 诱导后细胞与PLGA支架复合修复骨缺损的X片结果 实验组整个缺损区均可见到骨痂生成，成骨现象明显，已明显形成骨缺损区的桥接，而对照组仍仅在缺损两端有骨痂生成，缺损区中央部分无明显骨生成影像，见图4、图5。3 讨 论近年来随着分子生物学的飞速发展和广泛应用，MSCs的体外培养、诱导成骨对整形外科、创伤外科的发展起到了重要的推动作用。BMSCs作为骨组织工程学的种子细胞，在实验室和亚临床阶段的成骨研究是近几年来的热门研究。向成骨细胞诱导的条件已经非常成熟,在培养基中加入地塞米松、-甘油磷酸钠、维生素C就可以使之向成骨细胞分化6。本实验中观察到地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化，自诱导第3天可见部分细胞由长梭形逐渐变成长方形，并逐渐变为多角形，细胞饱满，多角形细胞比例高，部分区域细胞呈现漩涡状分布。第4天时碱性磷酸酶表达与非诱导组无明显差别,随后碱性磷酸酶表达开始随时间的延长而逐渐升高,与非诱导组相比较有统计学意义。原位杂交检测型胶原结果发现胞浆内可见大量棕黄色颗粒。Vonkossa染色可见钙盐沉积区域呈黑色，对照组为阴性反应。在组织工程的研究中,支架材料对再造的工程化组织同样具有重要作用。目前骨组织工程支架材料来源可分为无机材料和有机材料两大类。人工有机材料中的聚乳酸及其衍生物由于其良好的生物相容性、降解产物无毒性、易加工、具备一定强度等优点而在骨组织工程中得到越来越广泛的应用。PLGA具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性等优点并可精确地控制其分子量、降解时间及孔隙率和孔径等性能7,8。本实验采用的PLGA支架孔隙率在40%50%，既使孔隙相贯通，又满足了临床应用对力学性能的要求。此外，材料孔隙大小应满足骨单位和骨细胞生长所需空间。一般情况下，孔尺寸在200400 m时最有利于新骨生长。PLGA也存在一定的缺点，如疏水性强，与细胞的亲和性差，不利于种子细胞在支架上的黏附等，从而影响组织工程化骨组织构建的成功率。本实验应用多聚赖氨酸对PLGA进行修饰，使其亲和性改善，基本上满足了骨组织工程支架的要求。Vacanti等将骨膜成骨细胞与PGA复合培养，发现有新骨形成，证实了人工载体复合成骨细胞后成骨的可行性9。我们在此基础上进行了修复兔桡骨大节段骨缺损可行性的探讨，结果发现术后4周X线即可观察到骨样组织填充于缺损区，到术后8周时整个缺损区均可见到骨痂生成，成骨现象明显，已明显形成骨缺损区的桥接;而对照a和b组到术后8周时仍未见到有骨性愈合的表现，除缺损区两端有少量成骨外，全部由纤维结缔组织填充。以后，我们将在此研究的基础上，把成骨诱导的细胞与PLGA支架复合植入动物骨缺损模型，观察PLGA支架体内降解性能，为生产可用于临床的组织工程化活性骨奠定基础。【参考文献】 1 Kishimoto KN，Watanabe Y，Nakamura H，et al. Ectopic bone formation by electroporatic of bone morphogenetic protein-4 geneJ. Bone, 2002,312(4):340-347.2 Gupta MC, Theerajunyaporn T, Maitra S, et al. Efficacy of mesenchymal stem cell enriched grafts in an ovine posterolateral lumbar spine modelJ. Spine,2007,32(7):720-726.3 Zani BG, Kojima K, Vacanti CA, et al. Tissue-engineered endothelial and epithelial implants differentially and synergistically regulate airway repairJ.Proc Natl Acad Sci U S A,2008 ,105(19):7046-7051.4 Wang SL, Xie SY, Zhu LY, et al. Effects of poly (lactic-co-glycolic acid) as a co-emulsifier on the preparation and hypoglycaemic activity of insulin-loaded solid lipid nanoparticlesJ.IET Nanobiotechnol,2009,3(4):103.5 王岩松，刘丹平，周大利，等.成骨诱导后骨髓间充质干细胞与A-WMGC支架材料联合培养的实