酶联免疫吸附技术课件

第12讲 酶联免疫吸附技术,第三章 免疫学检测技术 第一节 免疫学检测基本原理 第二节 免疫组织化学检测技术 第三节 免疫印迹技术 第四节 酶联免疫吸附检测技术 第五节 放射免疫检测技术,基本内容,一、ELISA的原理 二、ELISA的分类 三、ELISA试剂盒的组成 四、ELISA的基本操作 五、ELISA操作注意事项 六、ELISA的应用 七、课堂小结 八、作业,一、ELISA的原理,ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）是一种集中免疫学、生物化学及光学检测技术为一体的测定方法，把抗原或者抗体固定化后，加入酶标抗体或抗原，形成抗原抗体复合物，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。,ELISA的优点： 操作过程简单易行 定量 快速 敏感 特异 实验设备简单 应用范围广 无同位素污染,一、ELISA的原理,1,2,3,4,是一种有机催化剂，无污染；,使底物供氢体由无色还原型水解变为有色氧化型；,很少量的酶即可导致大量的催化过程；,酶的活性高，敏感，高效。,“酶联”好在何处？,一、ELISA的原理,对酶的要求： 活性高，纯度高，催化转化率高； 具有抗原抗体共价结合的基团，专一性强； 标记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性； 产物易判定或测定； 酶活性不受样品中其他成分的影响（抑制或激活）； 无害； 性质稳定； 价廉； 易得，来源丰富。,一、ELISA的原理,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的要素： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂“； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物“； （3）酶反应的底物。 只要有三要素，就可设计出各种不同类型的检测方法。,一、ELISA的原理,ELISA可以分为直接法、间接法、夹心法、竞争法、Dot-ELISA和BAS-ELISA等。 1、直接法： 直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。,二、ELISA的分类,ELISA可以分为直接法、间接法、夹心法、竞争法、Dot-ELISA和BAS-ELISA等。 2、间接法： 将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量。,二、ELISA的分类,ELISA可以分为直接法、间接法、夹心法、竞争法、Dot-ELISA和BAS-ELISA等。 3、夹心法： 先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，再用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物。前者称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。,二、ELISA的分类,二、ELISA的分类,4、竞争法 标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。,二、ELISA的分类,5、斑点ELISA（Dot-ELISA） 用吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜（NC膜）为载体，将少量抗原点加于膜上，干燥后经过封闭液处理，滴加特异性抗原和酶标抗体（双抗体夹心法）进行反应。洗涤后滴加底物溶液。阳性反应在膜上出现肉眼可见的着色斑点。 Dot-ELISA常用于筛选单克隆抗体杂交瘤细胞；在各种病毒性疾病和寄生虫病的临床诊断与血清流行病学调查中亦广泛使用。,二、ELISA的分类,6、生物素-亲和素（BAS-ELISA） 亲和素是一种糖蛋白，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。,二、ELISA的分类,BAS在ELISA中的应用，有以下三种方法： BA法：固相抗体+待测抗原+生物素化抗体+酶标亲合素+底物显色。 BAB法：固相抗体+待测抗原+生物素化抗体+亲合素+酶标生物素+底物显色。 ABC法：固相抗体+待测抗原+生物素化抗体+亲合素-酶标生物素复合物+底物显色。,二、ELISA的分类,三、ELISA试剂盒的组成（7个）,1、固相载体： 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。最常用的材料是聚苯乙烯。ELISA载体的形状以微量滴定板（酶标板）最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为812的96孔式。 2、免疫吸附剂： 已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。,三、ELISA试剂盒的组成（7个）,3、酶标记物： 即辣根过氧化物酶( HRP)和碱性磷酸酶(AP)标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。 良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外酶标记物还要有良好的稳定性。,三、ELISA试剂盒的组成,4、酶的底物 5、洗涤液 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。,三、ELISA试剂盒的组成,三、ELISA试剂盒的组成,6、酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。,三、ELISA试剂盒的组成,7、参考标准品 定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。,1、准备试剂： #取样 #购买相关的试剂盒,四、ELISA的基本操作,2、反应条件的选择 #包被Ag或Ab浓度 #酶标二抗浓度 #温度 #时间等 3、按照试剂盒说明书标准化操作 #加样 #保温 #洗涤,四、ELISA的基本操作,4、比色 酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。,四、ELISA的基本操作,4、比色 优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为1%，重复性达0.5%。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。酶标仪的检测范围一般在0.0003.000之间，甚至更高。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读使用说明书。 酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15-30，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。,四、ELISA的基本操作,五、ELISA操作注意事项,1、加样: 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。,五、ELISA操作注意事项,2、保温 抗原抗体完成反应的保温过程称为温育。 温育常采用的温度有4（冰箱温度）、37、室温和43。4过夜最佳。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度，保温2h较好。43 20min可造成弱“+”假“-”。 保温的方式一般均采用水浴（ELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡）。,3、洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败，能达到分离游离的和结合的酶标记物的目的，还能清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。 洗涤的方式： 某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪，自动洗板要注意残留液量。 手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种，手洗效果最佳。,五、ELISA操作注意事项,4、显色 显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。,五、ELISA操作注意事项,5、比色 拭干板底附着的液体，将板正确放入酶标比色仪中，以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。,五、ELISA操作注意事项,6、结果判断 #注意夹心法假“-” #用cut-off(CO)值判断 #结合临床用药,五、ELISA操作注意事项,六、ELISA的应用,食品安全性： #农药残留 #生物毒素 #病原微生物 #寄生虫 #重金属污染 #转基因食品 #植物激素 #生物碱 #食品添加剂 #抗生素 #兴奋剂,饲料安全： &滥用添加剂（瘦肉精） &动物激素 &抗