定量分析技术课件

第三部分 鉴定技术,生物活性分子的分离与表征,第10章、电泳技术 第11章、定量分析技术 第12章、组分分析技术 第13章、生物活性测定技术,第11章、定量分析技术,一、紫外吸收法 二、Bradford法 三、BCA法 四、如何选择合适的蛋白定量方法,物理性质：紫外吸收法 化学性质：Folin酚试剂法（Lowry法），BCA法（Bicinchoninic acid 法），凯氏定氮法，双缩脲法（Biuret法），胶体金测定法，等等 染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、银染法 测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量为16）。,蛋白质的定量分析方法,蛋白质在紫外光区（190nm-360nm）有两个强烈吸收峰：280nm和190nm。,280nm有吸收的电子所需能量较少，因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)有芳香环，可吸收280nm波长的光子，苯丙氨酸（Phe）也有微弱吸收。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，因此相同浓度的不同种类蛋白质，其280nm的吸收值差别很大(图1)。,一、紫外吸收法,图1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱,图A是15g /ml蛋白的吸收光谱。图A中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明胶(G)的吸收光谱 图B是10g /ml RNA和DNA的吸收光谱。,280 nm光吸收法： 根据吸光值或蛋白质摩尔消光系数的文献值，可直接计算出样品溶液中蛋白质的浓度。 如果已知某一蛋白质在280 nm处的摩尔消光系数() ，测定蛋白质溶液280 nm吸光值后，根据公式：c =A/，可直接计算出蛋白质浓度。,优点： 不需添加任何试剂，因而对样品没有任何破坏； 测量极其简单迅速； 蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。 适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质。,缺点： 干扰测定的影响因素多，尤其是RNA和DNA在此波长均有强吸收, 所以一定要考虑样品中是否有核酸。要得到准确可靠的结果，必须严格控制样品溶液的pH和化学组成，使待测样品和标准样品的实验条件一致。 敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。 用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差较大。,蛋白质定量方法的改进,蛋白质+Cu2+ 化合物1+Cu+,蛋白质+Cu2+ 化合物1+Cu+ Cu+ +Tyr等+试剂乙化合物2,蛋白质+Cu2+ 化合物1+Cu+ Cu+ +BCA化合物2,Lowry 法的改进法。 碱性条件下，蛋白分子中的肽键与Cu2+形成络合物，并将Cu2+还原成Cu+；Cu+与BCA结合成紫色复合物，在562nm处吸收值与浓度呈正比。,二、BCA法,与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，灵敏度更高（微量检测可达到0.5g/ml），应用更加灵活。 可耐受高达5%的表面活性剂。,原理：该方法由Bradford于1976年建立。在酸性条件下，考马斯亮蓝与蛋白质结合后最大光吸收波长由465nm（红色）转移为595nm（蓝色），起作用的主要氨基酸是Arg，另外，His, Lys, Tyr, Trp和Phe也有作用。 25min呈最大光吸收，至少可稳定1小时,三、考马斯亮蓝染色法（Bradford法）,简便, 迅速，灵敏度较高。只需要一种反应试剂 影响因素较少。去污剂和两性物质对测定有干扰 小于3000Da 的多肽无法测定 蛋白浓度高时非线性 配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮蓝G250,实验操作步骤,室温放置5分钟后测595nm的光吸。 考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用乙醇洗涤后，用双蒸水清洗。 注意混匀，但不要剧烈震荡。,四、如何选择合适的蛋白定量方法？,定性分析（如纯化过程中）：可以使用简单、快捷的紫外吸收法； 定量分析（蛋白纯品、双向电泳、west-blot等）：使用精度高的Bradford法或BCA法。,Bradford法和BCA法的选择,注意事项,1、由于各种方法测定原理不同，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度可能会有较大差异。 2、即使是用同一种比色法测定同一样品，选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。 3、所有的