实验动物学微生物控制

第七节 实验动物的遗传（质量）监测,一、遗传标记的概念及其发展 1、遗传标记（Genetic Marker）的概念 遗传标记是指在遗传分析上用作标记的基 因，也称为标记基因。 遗传标记是一些等位基因或遗传物质，能在 动物体上以各种形式表现出的各种变异。 遗传标记的概念经历了从宏观到微观、从外 部到内部、从蛋白质到DNA的发展过程。,2、遗传标记概念的发展 形态学标记 能用肉眼观察和识别的外部性状。例如，动物 的毛色、角形、耳型、体型、外貌等。此法简单 直观，但标记数目少、多态性低、易受环境影响。 细胞遗传标记 主要是指染色体核型、带型和数量的变异等。此 法能反映出染色体结构和数目的多态性，但由于这 些变异往往带来有害的表型效应，生物难以忍受。,免疫遗传标记 以动物的免疫学特征为标记，主要是红细胞抗原 多态性和白细胞抗原多态性。 红细胞抗原多态性血型，以细胞表面的抗原而定 白细胞抗原多态性主要组织兼容性复合体（MHC），以白细胞表面的抗原而定。 生化遗传标记（蛋白质多态性标记） 同一种动物中，具有相同功能的蛋白质存在两种以上的变异体，有些可以用电泳方法区分其中的差异,分子遗传标记 分子遗传标记是以DNA多态性为基础的遗传标记，又称DNA分子标记或多态性DNA标记。 自20世纪70年代以来，随着分子生物学的发展，相继建立了多种分子遗传标记检测技术，例如，RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等 分子遗传标记的特点：遗传多态性高；检测方法简单快捷；遗传共显性，能分离出等位基因的三种基因型。,二、近交系的遗传监测 （一）形态学方法(形态学标记) （二）生化标记监测法 （生化遗传标记、蛋白质多态性标记） （三）免疫学方法（免疫遗传标记） （四）分子生物学技术（分子遗传标记）,第三章 微生物学质量控制的标准化 本章的主要内容： 第一节 无菌动物（GF或GFA） 第二节 悉生动物 （GN或GNA） 第三节 无特定病原体动物（SPF） 第四节 清洁级动物CL和普通级动物CV,国际分级法,各种动物国家标准分级,由于微生物净化程度的不同，其饲育环境也各不相同。 普通级动物通常饲育于开放系统； 清洁级动物饲养于半屏障系统； 无特定病原体动物饲养于屏障系统； 无菌动物及悉生动物饲养于隔离系统。不同等级实验动物的相互关系见图31,图3-1 各种等级实验动物的相互关系,一、基本概念 无菌动物（germfree animal ，GFA） 是指在动物体内、外均不带有用现有检测技术手段能够检出的微生物和寄生虫的动物。 无菌动物在自然界是不存在的。 无菌动物是个相对的概念，绝对的无菌动物是不存在的。 必须饲养在无菌隔离器中（见图3-2）。,第一节 无菌动物（GF、 GFA）,无菌监测的目的： 确保无菌状态 无菌监测的时间： 每年送检动物1-2次。 无菌监测的样品有： 粪便、尿液、垫料、涂 抹隔离器内壁用的棉拭 子等，进行细菌培养。,二、无菌监测,猕 猴,目前，国际上对无菌动物无菌监测的内容与方法尚无统一的标准。 被列入监测的细菌有：沙门氏杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、结核杆菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌等18种。 被列入监测的病毒有：鼠脑膜炎病毒、鼠肝炎病毒、鼠细小病毒和鼠脊髓灰质炎病毒等14种。,1、体形变小、寿命延长 无菌大小鼠一般生长发育比普通大小鼠慢，体形也要小些，而无菌动物的寿命却比普通动物要长很多。 2、盲肠肥大 无菌动物的盲肠比普通动物要大56倍，如无菌豚鼠的盲肠可达体重的13。无菌动物通常排稀便，排尿量少。 3、肠壁变薄、肝脏重量下降、心脏变小。,三、无菌动物的生物学特点,由于缺乏微生物的刺激，其淋巴结与脾脏发育不良，产生抗体的能力很弱； 过敏反应、对异体移植物的排斥反应以及自身免疫现象消失或减弱； 用低分子无抗原性饲料喂饲无菌动物时，血清中几乎不存在丙种球蛋白和特异性抗体。,4、免疫系统的改变,5、抗辐射能力强 普通动物受辐射后往往因细菌感染引起并发症而造成动物死亡。 无菌动物就不存在这种情况，因而提高了抗辐射能力。,1、微生物学与寄生虫学研究 研究宿主与微生物、寄生虫相互关系是无菌动物学研究重要内容之一。 中国预防医学科院微生物学研究所，用志贺氏痢疾杆菌攻击无菌豚鼠，几天后引起豚鼠死亡。但用其攻击已知菌豚鼠，则该豚鼠没有死亡，证明了微生物间有拮抗作用。 美国、波兰科学家用无菌动物研究发现了肠道菌群与寄生虫依存关系等。,四、无菌动物的应用,2、免疫学研究 无菌动物的体内既无抗原也无特异性抗体。处于一种免疫“原始状态”。很适于各种免疫功能的研究。 无菌动物对外来抗原的刺激，有迅速、单一和持久作出反应的特性。 是用来生产高效、优质疫苗的最理想的动物。,有些致癌病毒能通过生殖细胞或通过胎盘屏障垂直传递给下一代，如白血病病毒。 某些微生物的代谢产物如大肠杆菌的乙基硫胺酸具有致癌作用。 某些微生物在其代谢过程中能使不致癌的物质转变成致癌物质，如苏铁素单独喂给无菌大白鼠时没有致癌性，而给普通大白鼠时，苏铁素被降解成致癌物质而诱发结肠癌。,3、肿瘤学研究,无菌动物是老年学研究的理想动物模型。因为无菌环境排除了细菌感染的可能，使研究生命的终点成为现实。 无菌大鼠的心、肺、肾、脑等部位都没有与年龄相关的病变，普通大鼠则有。 普通大鼠的寿命一般在2年左右，而无菌大鼠的寿命可达34年，由此说明微生物与机体的老化有关。,4、老年学研究,无菌动物是营养学研究的良好模型。 目前，已知多种营养成分都是靠细菌降解在肠道中合成。如维生素B、K等多种维生素。利用无菌动物便可研究哪些细菌合成了这些维生素。 限制采食而延长动物寿命，实验结果表明限制采食的大、小鼠比自由采食的大、小鼠寿命长6个月。,5、营养学研究,用无菌动物研究放射的生物学效应，可以将由放射引起的症状和因感染发生的症状区分开来。 在无菌状态下，淋巴系统、神经系统，特别是消化道实质的损伤是在一个非常洁净的环境中，没有细菌感染，这样就可以观察到放射线对机体产生的直接效应。,6、放射医学研究,现代医学已证明，许多心血管疾病与机体的胆固醇代谢密切相关，而肠道微生物直接影响胆固醇代谢。 许多试验都证实了微生物在调节胆固醇代谢水平方面及胆汁酸的肝肠循环中起重要作用。,7、心血管疾病研究,用无菌大鼠作龋齿病研究，发现引起龋齿的病因不是乳酸杆菌，而是一种链球菌有致龋齿作用，从人体龋齿中分离出三株厌氧性链球菌接种到无菌小鼠和大鼠的口腔内，证明有高度致龋齿作用。 各种粘液性链球菌致龋齿作用最强。,8、牙病学研究,药物或其它物质的毒理作用常常与肠道细菌代谢产物有关。如普通豚鼠对青霉素敏感，而无菌豚鼠则相反。 研究证明，青霉素过敏是因肠道菌代谢过程引起的过敏，通过对无菌动物的研究，可准确地分析出各种物质的毒理作用。,9、毒理和药理学研究,免疫缺陷动物-裸鼠，在无屏障环境下极易感染，很难饲养繁殖，只有在屏障系统中这些动物才能生存、繁衍。 在临床上利用无菌技术诞生了“净化医学”，使无菌环境在临床上得到广泛应用，美国患者Darid患联合免疫缺陷病(SCID要与AIDS相区别)，剖腹产后养育在无菌环境中生活了12年。,10、无菌技术在生物医学中的应用,将肿瘤病人置入屏障系统内，便能承受高剂量抗癌药物治疗，又可减少因免疫系统损害而引起感染。 将烧伤病人置于无菌隔离室内，可防止病人因皮肤破坏引起细菌感染而导致败血症。 器官移植病人为防止术后感染都必须生活在无菌隔离室。,一、基本概念： 悉生动物(gnotobiatics,GN)又称已知菌动物、指定菌动物。是指动物体内外带有已知微生物的动物。 悉生动物是在无菌动物基础上，人为地将某一种或多种微生物植入到无菌动物机体内而形成的。,第二节 悉生动物（GN、GNA）,单菌动物(monognotoxenic)， 双菌动物(dignotoxenic)， 三菌动物(trignotoxenic)， 多菌动物(polygnotoxenic)， 不同国家的已知菌动物所带的细菌种类与数量不尽相同，见表3-1。,根据植入的细菌数不同可分为,表3-1 在已知菌动物中各国植入的细菌,悉生动物来源于无菌动物，其体内、外有已知种类的细菌定居，形成了动物与微生物的共生复合体。 悉生动物肠道内存在能合成某种维生素和氨基酸的细菌。 悉生动物的生活力较无菌动物强，抗病力明显增强，也易于饲养管理。,二、悉生动物的特性,在有些实验中，悉生动物可以作为无菌动物的替代动物。 如中国药检所的五联菌悉生动物是将大肠埃希氏杆菌、表皮葡萄球菌、白色葡萄球菌、粪链球菌和乳酸杆菌等5种细菌接种到无菌小鼠，可代替无菌小鼠进行药物检定。 在免疫学实验中，无菌动物不发生过敏反应，而感染一种大肠杆菌的悉生动物就会出现过敏反应。,饲养:悉生动物与无菌动物一样，也必须饲养在隔离器（或隔离系统）中，其方法与无菌动物相同。因为这种动物是带菌的，所以隔离器内也有这种细菌的存在。 监测:对悉生动物也需要定期监测。 一是监测被污染与否 二是监测接种的细菌是否定居,三、饲养与监测,1、微生物学研究 在断奶前后的无菌动物体内有目的地植入单一或多种细菌，从而可观察细菌对机体的作用。 选用悉生动物，可观察微生物与微生物之间、微生物与机体之间相互关系和菌群失调现象。 当对多种悉生动物施加物理、化学等其它致病因子时，可观察机体、微生物、致病因子等三方面相互作用的关系。,四、悉生动物在生物医学中的应用,普通动物每克肠内容物约有106-1012个细菌，一种细菌就是一种抗原。因此，用普通 动物很难制备较纯的抗体。 将一种细菌植入到无菌动物体内，就可以制备出抗该种细菌的高纯度、高效价的抗体。 曾有人利用无菌家兔来制备诊断用百日咳的抗体。,2、抗体制备,克山病的病因学说有2种，一种是矿物盐学说认为该病是因体内长期缺硒引起的；另一种生物学说认为镰刀状黄曲霉菌是引起克山病的元凶。 中国农大的学者用植入黄曲霉菌动物的实验研究证明，动物的症状与人的症状相似，硒不足只能加重病情，而不会诱发克山病。,3、克山病病因学的研究,4、微生物和寄生虫相互关系的研究：很多研究表明，宿主消化道内的微生物状况直接或间接影响着寄生虫在宿主体内寄生能力。 5、其它方面研究：还广泛应用于人和动物的骨髓移植，肿瘤学、病毒学、营养学、生理学、外科病人感染控制等方面的研究。,一、基本概念： 无特定病原体动物(specific pathogen free animal,SPF)是指机体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物，而非特定的微生物和寄生虫是允许存在的。 1978年，英、美、日、法等国协商制定了应排除的病原微生物小鼠有22种、大鼠18种、豚鼠18种、地鼠15种、兔16种。,第三节 无特定病原体动物（SPF动物）,我国（1992年）医学实验动物标准中，规定了SPF动物应排除的病原微生物和病毒的种类如下： 细菌：小鼠有19种、大鼠18种、豚鼠16种、地鼠16种、兔16种、猫2种、犬3种、猴3种。 病毒：小鼠有17种、大鼠13种、豚鼠7种、地鼠5种、兔4种、猫6种、犬6种、猴6种。 详见表3-1,表3-2 卫生部对实验动物生物监测标准,二、饲养与监测 SPF动物来源于无菌动物或悉生动物，必须饲养在屏障系统中，所以屏障系统也称为SPF设施。 通常SPF动物室都经严格净化，严格控制病原微生物的侵入。,在对SPF动物饲养过程中，时间长了，难免不发生污染。 所以不仅对SPF动物需要定期监测，而且对SPF动物一般都作周期性重建(F56代淘汰制度)。,三、应 用 国际上公认SPF动物适用于所有科学研究，是目前国际标准级别的实验动物。 生产各种疫苗所用的动物都应为SPF级动物。 SPF动物应用价值在于它没有人畜共患病病原体、没有主要传染病病原体、没有对实验结果可能产生干扰的微生物。 SPF动物不存在隐性感染（清洁级就有）。 隐性感染不会影响动物健康的外表，容易被忽视，但却能