优良鸡品种禽白血病净化技术操作规程.doc

ICS11.220B41DB45广西壮族自治区地方标准DB 45/T XXXXX2011优良鸡品种禽白血病净化技术操作规程点击此处添加标准英文译名点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（本稿完成日期：2010年12月）2011 - XX - XX发布2011 - XX - XX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布目次前言II引言III1范围12术语和定义13试验材料23.1试剂23.2DF-1细胞系23.3检测样品23.4仪器设备及耗材24操作程序34.1种鸡群的ALV流行病学调查34.2种鸡群的排毒规律的确定34.3种鸡群的净化34.4ALV净化后的饲养管理34.5ALV净化效果检验4附录A（规范性附录）DF-1细胞系培养条件及溶液的配制5附录B（规范性附录）禽白血病毒检测样品的采集7附录C（规范性附录）禽白血病抗原检测试剂盒9附录D（资料性附录）种鸡群的ALV排毒规律13附录E（规范性附录）ALV的分离和分离培养物的检测14参考文献16前言本标准根据GB/T 1.12010给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出。本标准起草单位：广西大学动物科学技术学院。本标准主要起草人：韦 平、韦天超、张胜斌、吴天威。本标准为首次发布。引言禽白血病（Avian leukosis）, AL是由反转录病毒科的禽白血病/肉瘤病毒群病毒（ALV/SV）引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。它可诱发产生肿瘤，造成鸡只的直接死亡；也可以产生非肿瘤综合症，表现为生长发育不良、生产性能下降，同时引起免疫抑制导致抵抗力下降，引发多种疾病。该病是危害我国养禽业的重要疫病之一。禽白血病病毒分为外源性病毒（包括A、B、C、D和J亚群）和内源性病毒（包括E、F、G、H和I亚群），其中A、B、C、D、E和J这六个亚群的自然宿主是鸡。本标准仅涉及与鸡相关的亚群。禽白血病在农业部发布的第1125号公告的一、二、三类动物疫病病种名录中属二类动物疫病。在国际种禽贸易中，外源性白血病感染是最主要的检测对象之一。该病目前对我国养禽业的危害很大，特别是在我国地方肉鸡品系中，禽白血病感染情况比较严重。因此，加强地方优良鸡品种禽白血病的净化和防控，对保护我国养禽业的发展具有重要的意义。目前，禽白血病的防制主要是通过对鸡的原种群开展外源性病毒的净化工作。本技术规范在实验室研究的基础上，经生产应用验证后制订，适合广西地方优良鸡品种禽白血病净化操作。优良鸡品种禽白血病净化技术操作规程1 范围本标准规定了广西地方优良鸡品种禽白血病净化的检测样品的采集、检测方法、净化的程序及技术指标。本标准适用于广西地方优良鸡品种禽白血病的净化。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1 禽白血病（Avian leukosis, AL）和禽白血病病毒（Avian leukosis virus, ALV）禽白血病（Avian leucosis）, AL是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus), ALV和禽肉瘤病毒(Avian sarcoma virus), ASV群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。它可引起病鸡严重生长发育不良、受精率和孵化率等生产性能下降，同时可发生免疫抑制，导致疫苗免疫效果不佳甚至失败并引起肿瘤死亡。ALV既可通过种蛋垂直感染，也可以水平传播，因此该病一直是种鸡和蛋鸡生产中危害严重的疫病。禽白血病病毒(Avian luekosis virus), ALV归属于反转录病毒科，a反转录病毒属。病毒粒子为一直径为80120nm（平均是90nm）的球状物，其外周是囊膜糖蛋白，其中gp85基因是囊膜蛋白表面的主要成分，主要决定了病毒亚群的特性；内部病毒子核心，有一主要的群特异性抗原p27蛋白，其为核衣壳蛋白，主要用于群特异性抗原的检测。2.2 酶联接免疫吸附实验( Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA )酶联接免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay)是在免疫酶技术(Immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原），再加相应酶标记抗体（抗原），生成抗原（抗体）待测抗体（抗原）酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产物成正比，从而检测出待测样品是否含有特异的抗原抗体。此方法尤其适合于大量样品的检测。2.3 DF-1细胞系DF-1细胞系（DF-1 cell line）是来自0系鸡的CEF的传代细胞系，可连续传代培养，属于C/E细胞，是具有对E亚群内源性ALV具备抵抗力的细胞系，主要用于外源性ALV病毒的分离与鉴定。3 试验材料3.1 试剂3.1.1 禽白血病病毒p27抗原ELISA检测试剂盒用于群体检测鸡群是否存在ALV感染和感染比例的ELISA抗原检测试剂盒，目前商品化的ELISA试剂盒主要为IDEXX公司和BIOCHECK公司的产品。3.1.2 禽白血病病毒血清抗体ELISA检测试剂盒用于检测血清样品ALV抗体，了解鸡群感染的ALV的亚型及其感染比例。商品化的ELISA试剂盒主要有检测A/B亚群和J亚群ALV血清抗体两种（IDEXX公司产品）。3.1.3 其他试剂：细胞培养用的试剂及其配制方法见附录A。3.2 DF-1细胞系用于对ALV病毒进行分离培养，所用培养液为加2%10%胎牛血清的DMEM培养液（见附录A）。3.3 检测样品血清、泄殖腔棉拭子、胎粪或蛋清，血浆。3.4 仪器设备及耗材3.4.1 所需仪器设备如下： 小型高速离心机； 水浴锅； 旋涡振荡器； 乳钵或玻璃研磨器； 微量加样器：200 L1 000L、40 L200 L、5 L40 L、0.5 L10 L等多种规格； 酶标仪； 超净台； 二氧化碳培养箱； -20冰箱； 液氮罐； 细胞瓶；3.4.2 一次性耗材如下： 手套； 离心管：1.5 mL和0.5 mL； 吸头：1 000 L、200 L、5 L40 L、0.5 L10 L等多种规格。4 操作程序4.1 种鸡群的ALV流行病学调查对需要净化的广西地方优良品系鸡种鸡群，首先进行ALV流行病学调查，采集鸡群各个日龄段（12w、16w、20w36w）的样品标本（血清、泄殖腔棉拭子、胎粪或蛋清）（采集方法与要求见附录B），使用ELISA商品试剂盒（IDEXX或者Biocheck公司产品）对样品进行检测：用棉拭子、胎粪或蛋清检测p27抗原，了解鸡群ALV的感染及排毒情况；用血清样品检测ALV血清抗体，主要检测A/B亚群和J亚群ALV血清抗体，用于了解鸡群感染的ALV的亚型及其感染比例。具体操作与结果判定根据试剂盒附带的使用说明书进行（见附录C）。4.2 种鸡群的排毒规律的确定分析种鸡群ALV的流行病学调查数据，平行比较不同日龄鸡的p27抗原检测阳性率和公、母个体p27抗原检测阳性率，找出鸡群的排毒规律（示例见附录D）。4.3 种鸡群的净化4.3.1 ALV的ELISA检测根据流行病学调查发现的公母鸡p27抗原检测阳性率高峰的情况来确定检测样品采样时间点，用ELISA试剂盒对原种鸡群进行ALV的检测与净化。公鸡可采集泄殖腔棉拭子检测p27抗原，母鸡可收集蛋并采集蛋清样品冻融3次后检测p27抗原，淘汰抗原检测阳性鸡，对其后代种鸡进行同样检测与净化，连续进行35个世代种鸡的ALV检测与净化，将鸡群p27抗原检测阳性率降低到2%以下。4.3.2 ALV病毒分离与检测禽白血病群特异性p27抗原检测阳性率降低到2%以下时，受ALV的ELISA试剂盒的检测敏感度限制，仍然采用ELISA方法检测ALV来净化种鸡群效果将不理想。因此，必须结合病毒分离方法进行ALV的净化，才能将ALV彻底从种群中清除掉。（分离外源性ALV用的DF-1细胞系的培养条件及溶液的配制见附录A，ALV的分离与分离培养物的检测见附录E。）4.4 ALV净化后的饲养管理鉴于禽白血病除了垂直传播之外，还存在有水平传播，所以经过检测筛选后留种的鸡群需要进行单独的饲养。4.4.1 栏舍挑选出来留种的种鸡的饲养鸡栏及其环境必须是经过严格消毒包括熏蒸的栏舍。4.4.2 饲具、水具需要经过消毒，最好是全新的。4.4.3 饲养员专人饲养特别是人工输精的人员要固定，避免串栏或者其他人为原因造成感染。4.4.4 鸡群的饲养经净化挑选出来留作种用的鸡群，不得与原鸡群或者其他未经净化的鸡群一起混养，避免水平传播。4.4.5 活疫苗的使用使用确定无污染的疫苗，减少疫苗外源性病毒污染的可能性。4.4.6 鸡蛋的卫生消毒以及单独孵化和出雏孵化室、孵化器、鸡蛋需进行严格消毒。凡阴性鸡所产的种蛋要单独孵化、出雏，后备种鸡要单独隔离饲养。4.5 ALV净化效果检验为了检验净化的效果，需要进行净化后的跟踪检测。主要包括以下几个方面：4.5.1 残次鸡苗的p27抗原检测残次鸡苗是p27检测阳性率较高的群体，其数量的多少和p27阳性检出率在一个方面说明了净化工作的效果。对经净化的和未经净化的配套系所产生的残次鸡苗的数量以及p27检测阳性率的比例进行比较，可获得有用的数据。4.5.2 净化后的配套系祖代的p27抗原检测阳性率的比较此部分为继续跟踪筛选出来的鸡群，观察其p27抗原检测阳性的变化规律。4.5.3 净化前后父母代的p27抗原检测阳性率的比较跟踪检测净化后配套系所产生的父母代的p27抗原检测的阳性率，选择与未净化父母代相近的周龄进行采样检测比较。4.5.4 净化后的商品代p27抗原检测的阳性率对已经过净化的配套系出来的商品代抽检，了解净化的的效果。一方面对商品代进行检测了解其阳性率的比例，进而了解祖代的阳性率在经过逐级放大后的危害；另一方面也可以此数据作为基础反推，证实留作种用的祖代鸡群应该进行长期的、多次的禽白血病净化检测工作，才能保证其健康和良好的生产性能。AA附录A （规范性附录）DF-1细胞系培养条件及溶液的配制A.1 DF-1细胞系培养条件A.1.1 细胞培养时，生长液为加入10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，维持液为加入2%胎牛血清的高糖DMEM培养液，培养条件为含5%二氧化碳的37的恒温培养箱。A.1.2 接毒以后，维持培养67天可以消化细胞继续传代并取出部分细胞用于检测。A.2 细胞培养基及细胞培养的各种液体配方A.2.1 PBS（phosphate buffer saline）液 NaCl：8g； KCl：0.2g； KH2PO4：0.2g； Na2HPO4：1.15g ；加三蒸水溶解并定容至1000mL，分装高压。A.2.2 胰酶消化液 NaCl：8g； KCl：0.4g； 葡萄糖：1g； NaHCO3：0.6g； 胰蛋白酶：0.5g； EDTA：0.2g；加三蒸水溶解并定容至1000mL，0.22m滤膜过滤，分装备用。A.2.3 高糖DMEM培养液（High-glucose） NaHCO3：3.7g； 商业高糖DMEM粉：1小包（13.4g/包）； ddH2O：1000mL（需要提前高压好）； 青链霉素双抗：4万单位（经过过滤无菌处理）；充分溶解后，经0.22m滤膜过滤除菌。A.3 其他液体配方A.3.1 1 mol/L PBS(pH 7.2)的配制1 mol/L PBS(pH 7.2)的配制按下列方法进行配制： NaCl：8.0 g； KCl：0.2 g； Na2HPO4：1.44 g； KH2PO4：0.24 g；双蒸水：定容至1 000 mL；在800 mL双蒸水中依次加入其余成分，用1 mol/L盐酸调节溶液的pH至7.2，加水定容至1 000mL，1.034105 Pa高压灭菌25 min。室温保存。A.3.2 70酒精的配制70酒精按下列方法进行配制： 无水酒精：700 mL； 灭菌双蒸水：300 mL；在700 mL无水酒精中加入300 mL灭菌双蒸水，-20 保存。 附录B （规范性附录）禽白血病毒检测样品的采集B.1 泄殖腔棉拭子采样B.1.1 器材棉签，100 孔离心管盒，2 mL 离心管，保温箱，冰袋，剪刀，透明胶，记录表，笔，口罩，手套等。B.1.2 步骤（1）先将PBS 液分装于2 mL 离心管中，每管1mL，将装有PBS 液的离心管放入离心管盒，每盒放92 个，将装有PBS 液离心管的离心管盒放于泡沫保温箱内加冰袋后用透明胶封好（暂时不采的放置2 8冰箱冷藏保存备用）。（2）采样五人一组（群体笼）; 四人一组（个体笼）。抓鸡、读翅号（笼号或脚号）人口齿清楚、读数准确。记录人记翅号（笼号或脚号），每记录10 个样时与拿离心管盒的人核对数量是否吻合。保定人使鸡肛门露出。采样人将棉签插入泄殖腔3-3.5cm，稍用力沿泄殖腔内壁顺、逆时针各二转后取出，尽量不带鸡糞，剪留插入泄殖腔端于装有PBS 液离心管中，尽量留长，以能盖上离心管盖为宜，经常擦拭剪刀，使剪刀不粘鸡糞、不潮湿，以尽量减少交叉污染的机会。持离心管盒人开、盖离心管，每采10 个样时与记录人核对数量是否吻合。（3）检查记录表记录是否完整；记录数与所采样品的数是否吻合。（4）装箱密封后尽快送到实验室，并将所采样品放入实验室-20 冰箱中冷冻过夜，以待第二天检测。B.2 静脉采血样B.2.1 器材2 mL(或2.5 mL)一次性注射器，1.5 mL 离心管，离心管盒，透明胶，保温箱，冰袋，记录表，笔等。B.2.2 步骤（1）将1.5 mL 离心管包好，121 ，灭菌30 min，干燥后备用.（2）采血 5人/组7人/组，一人记录其余人采血（或者一人记录，一人抓鸡读翅号，其余人采血）。记录人记录翅号（或脚号、笼号）并拿离心管盒，时刻注意检查记录数与所采样品数量是否吻合，每盒采92 孔样。采血人 抓鸡、读翅号（或脚号、笼号）、采血，采血前应当调空一笼，以便放采了血的鸡，采血时一手中指放在鸡背上，食指和无名指分别放在鸡的两个翅下，大拇指将翅根部静脉处的羽毛拨开,另一只手将注射器插入静脉内采血0.5 mL 后，（采血时注意规范操作，不能直接刺进静脉血管里，而应在距血管约0.5 cm 的一则斜插入血管里,这样抽出注射器时就起到止血的作用，再用大拇指压住插针处的静脉），最后将鸡放入空笼中，卸下针头，打开离心管盖，将血沿着离心管内壁缓慢注入后盖好，将离心管放入离心管盒，报翅号（或脚号、笼号）给记录人。 检查记录表填写是否完整、记录数量与所采样品的数量是否吻合。 将装有所采样品的离心管盒（92 个样）放入有冰袋的保温箱后封口尽快回实验室。 到实验室后尽快离心出血清。B.3 蛋清样品的采集B.3.1 器材200 L1 000L 微量加样器、1 000 L 吸头、1.5 mL离心管、100 孔离心管盒、蛋托、保温箱，冰袋、透明胶，记录表，笔，口罩，手套等。B.3.2 步骤（1）将1.5mL 离心管盖盖上，包好，121，灭菌30 分钟，干燥后备用.（2）采样 4 人/组，一人记录、一人敲蛋其余人采蛋清。记录人记录蛋号并拿离心管盒，时刻注意检查记录数与所采样品数量是否吻合，每盒采92 孔样。敲蛋人镊子大头烧过后在种蛋的大头敲一个小孔，然后用镊子挑破蛋膜，注意如果镊子碰到了蛋清需用酒精消毒烧过镊子后敲下一枚蛋。采蛋清人用200 L1 000L 微量加样器吸取蛋清打入1.5 mL离心管中，然后交给记录人编号放入100 孔离心管盒中，注意取完一枚蛋蛋清后应更换枪头取另外的蛋清。 检查记录表填写是否完整、记录数量与所采样品的数量是否吻合。 将装有所采样品的离心管盒（92 个样）放入有冰袋的保温箱后封口尽快回实验室。 到实验室后尽快将样品放入-20 冰箱中。附录C （规范性附录）禽白血病抗原检测试剂盒Avian Leukosis Virus Antigen TestC.1 用途爱德士禽白血病抗原检测试剂盒(ALV-Ag)是用于禽白血病病毒(ALV) p27抗原检测的酶联免疫检测试剂。C.2 概述ALV可引起不同的肿瘤性疾病，包括淋巴白血病、成红细胞瘤、成髓细胞瘤等。p27是ALV病毒群（A，B，C，D，E和J亚群）的主要gs抗原，高度保守，因而p27抗原的检测是ALV抗原检测的基础。外源性ALV可以通过直接或间接接触在禽之间水平传播，或从感染的母鸡经蛋垂直传播。母鸡的病毒血症与病毒通过蛋清先天性传播密切相关。内源性白血病病毒序列存在于大多数正常鸡群的基因组中。C.3 试验原理本试剂用于检测p27，此抗原存在于包括内源性病毒在内的所有ALV亚群中。推荐采用蛋清和泄殖腔拭子进行检测，虽然血清在ALV抗原的检测中是有效的，但由于潜在内源性病毒序列的干扰，因而在外源性病毒的检测中不推荐采用血清样品。 在抗p27抗体包被96孔酶联检测板中，样品的p27与包被的抗体可以形成复合物。洗掉未结合的物质，再加入辣根过氧化物酶标记的抗p27抗体，后者与结合在孔中的p27结合。随后，洗掉未结合的标记物，加入底物液，生成的颜色与检测样品中的p27含量有关。由于清蛋白较粘稠，本说明书介绍了改进的样品处理/洗涤方法。C.4 试剂数量C.4.1 抗p27抗体包被板-5板C.4.2 阳性对照：灭活病毒缓冲液，含有蛋白稳定剂 ，叠氮钠防腐-1.9mLC.4.3 阴性对照：含有蛋白稳定剂的缓冲液中，与p27无反应，叠氮钠防腐 -1.9mLC.4.4 辣根过氧化物酶标记（兔）抗p27抗体，庆大霉素防腐-50mLC.4.5 样品稀释液：含有蛋白稳定剂的缓冲液，叠氮钠防腐-235mLC.4.6 TMB底物液：3,3,5,5 四甲基联苯胺-60mLC.4.7 终止液-60mLC.4.8 20倍浓缩洗涤液（用于清蛋白样品的洗涤）-235mLC.5 其他需要自备的器材精密移液器和连续移液器，一次性吸头，96孔酶标仪，样品稀释试管，蒸馏水或去离子水，液体的转移和吸取装置（洗板机）。C.5.1 注意事项处理所有的ALV材料以免ALV的传播，阳性对照可能成为ALV的传染源，尽管阳性对照已通过化学处理失活，但不能认为其完全失活。试剂盒的一些成分含有叠氮钠作为防腐剂，废弃物要用大量的水冲洗，以防形成铜或钠的复合物，在震动的情况下会爆炸。不要将TMB暴露于强光和任何氧化剂下，所有的试剂应在27储存，所有的废弃液应在丢弃前合理处理以免污染。不要使用超过有效期的试剂，不同批号的成分不要混用。操作过程中移液和洗涤必须做到准确、精确。严格遵守这些条款可以获得最好的结果。仅限于兽医使用。C.5.2 样品处理 清蛋白-收集蛋清，直接加到ELISA反应板中。冻融样品可降低其粘稠度。 泄殖腔拭子-将泄殖腔拭子加到1mL培养液中或样品稀释液中冷冻。检测前，将样品恢复至室温，让杂质沉淀下来。吸取100 l上清，加到ELISA反应板中。 血清-用于p27的常规检测，血清样品直接加到反应板中。因为内源性病毒的干扰作用，不推荐使用血清样本进行外源病毒p27的检测。C.6 操作步骤（适用于清蛋白以外的样品）使用前所有试剂应恢复至室温。试剂应轻轻地旋转或震荡予以混合。C.6.1 取出抗体包被板，在记录表上记录样品的位置。C.6.2 在A1和A2孔内各加入100l未经稀释的阴性对照。C.6.3 在A3，A4孔内加入100l未经稀释的阳性对照。C.6.4 在剩余的孔内分别加入100l被检样品。每一样品加2孔。C.6.5 室温下孵育60分钟。C.6.6 用大约350l蒸馏水或去离子水洗涤板孔，重复35次。C.6.7 每孔加入100l辣根过氧化物酶标记（兔）抗p27抗体。C.6.8 室温下孵育60 min。C.6.9 重复步骤6。C.6.10 每孔加入100lTMB底物液。C.6.11 室温下孵育15 min。C.6.12 每孔加入100l终止液，使反应终止。C.6.13 酶联检测仪空气调零。C.6.14 测量并且记录样品和对照于650 nm波长的吸光值A(650)。C.6.15 计算结果。C.7 清蛋白样品洗涤方法清蛋白样品有时很难用上述标准的方法，用水完全从板子上清洗下来。本试剂盒准备了20倍浓缩洗涤液，用于清蛋白样品的洗涤。C.8 洗涤液的制备浓缩洗涤液应恢复至室温并使沉淀的盐溶解。使用前浓缩洗涤液应用蒸馏水或去离子水1:20倍稀释（例如：每板用20 mL浓缩液加上380 mL水）。C.9 清蛋白样品洗涤方法除了步骤6和步骤9的洗涤方法外，清蛋白样品的检测步骤与上述步骤相同。吸出对照和被检清蛋白样品孔中的液体，每孔加入大约350 ul上述制备的洗涤液，浸泡2 min，吸出孔中液体。再重复4次，但每次不用再浸泡2分钟。C.10 结果阳性对照的平均值减去阴性对照的平均值(（PCx-NCx）必须大于0.200，阴性对照平均吸收值必须小于或等于0.150，试验方能有效。被检样品中是否含有p27抗原与其A(650)和阳性对照的平均值的比值有关。阳性对照已经标准化处理，显示显著的抗原水平(大约10 ng/mL)。被检样品抗原的相对含量通过计算样品与阳性对照比值（S/P）来确定。如果S/P小于等于0.2，样品为阴性； 如果S/P大于0.2，样品为阳性。C.11 计算方法C.11.1 阴性对照平均值的计算（NCx）NCx=A1孔 A(650)+A2孔A(650)/2C.11.2 阳性对照平均值的计算（PCx）PCx= A3孔 A(650)+A4 孔A(650)/2C.11.3 S/P的计算S/P=（样本平均值阴性对照平均值）/（阳性对照平均值阴性对照平均值）IDEXX公司ALV-AB和ALV-J血清抗体检测与Biocheck公司p27抗原检测操作详情见试剂盒说明书。附录D （资料性附录）种鸡群的ALV排毒规律D.1 示例1：在广西三黄鸡的流行病学调查中，我们通过对不同日龄种鸡p27抗原检测，将得到的数据进行分析，发现母鸡在开产后（在28w左右），在产蛋高峰期检测阳性率都维持在一个相对比较高的水平，而公鸡在22 w和34 w的检测阳性率较高，因此，可以抓住公母鸡p27抗原检测敏感期的不同来开展ALV净化，ALV阳性率由原来的15%左右降低至2%以下。D.2 示例2：在广西麻鸡的流行病学调查中，我们通过对不同日龄种鸡p27抗原检测，将得到的数据进行分析，发现母鸡在28w左右，p27抗原检测阳性率维持在一个相对比较高的水平，而公鸡在3033w的检测阳性率较高，因此，可以抓住公母鸡p27抗原检测敏感期的不同来开展ALV净化，麻鸡ALV阳性率也下降了24个百分点以上（净化前达48%左右）。目前广西种鸡群的繁殖均采用人工授精的方式进行（公鸡：母鸡的比例大多为1：251：30），此时，种公鸡的净化对于整个净化工作的影响力远比在自然交配情况下种公鸡净化对整个净化工作的影响力要高得多，在净化工作中需要加以特别的重视，切断由于人工授精而造成带毒公鸡将ALV传播到阴性母鸡的可能。B附录E （规范性附录）ALV的分离和分离培养物的检测E.1 分离病毒用细胞在分离外源性ALV时，考虑到E亚型的内源ALV的干扰，必须选用C/E细胞（对内源性ALV-E有抵抗力的细胞），如0系SPF的CEF或来自0系CEF的传代细胞系DF-1细胞。如果不使用C/E细胞来分离培养ALV，就不能排除内源性ALV-E的干扰，就不能得出分离到外源性ALV的结论。E.2 样品采集和处理E.2.1 血浆： p27抗原检测阳性率降低到2%以下时，选取400羽600羽鸡的小群，全群无菌采集抗凝血（用肝素钠做抗凝剂），1 500 r/min离心15 min后，取上清接种于DF-1细胞；E.2.2 同时进行疑似ALV污染的活疫苗检测例如：马立克氏病细胞结合疫苗从液氮中取出后，在含有疫苗的细胞悬液中加入9倍10倍的灭菌注射用水，将细胞悬液移至小试管混匀，4 放置10 min，让细胞在低渗下裂解死亡，然后接种于DF-1细胞。E.3 病毒接种细胞的方法本规定推荐使用来自0系CEF的传代细胞系DF-1。E.3.1 在37 水浴中提前预热消化液（0.25%Trypsin, 2.21 mM EDTA, pH 7.28.0）和DMEM（high-glucose）；E.3.2 弃去培养了4 d的细胞培养液上清；E.3.3 50 mL 瓶中加入5 mL 胰酶，25 mL 瓶中加入3 mL 胰酶，10 mL 平板中加入2 mL 胰酶。在加入胰酶2 min后，再加入等体积的细胞培养液（含有10% FBS 的DMEM）；E.3.4 1 200 转离心5 min后弃去上清，加入适量细胞培养液，使细胞浓度达到1105 个2105 个细胞：E.3.5 然后将细胞和培养基混匀，通常来讲：E.3.6 50 mL 瓶：加入200 mL 的新鲜生长液E.3.7 25 mL 瓶：加入100 mL 的新鲜生长液E.3.8 10 mL 瓶：加入40 mL 的新鲜生长液E.3.9 将细胞悬液加入到24 孔板中，每孔0.5 mL；E.3.10 每孔加入分离好的50 ul 血浆样品以及阴阳性对照；E.3.11 于细胞培养箱（37 ，5% CO2）中培养细胞24 h；E.3.12 24 h后将细胞培养液更换为细胞维持液（含有2% CS 的DMEM），培养6 d7 d；E.3.13 8 d以后，将细胞反复冻融3 次；E.3.14 最后一次冻融后，收集每一个样品培养物注意事项： 在 37水浴锅及培养箱中可以加入适量的抗真菌试剂，避免细胞的污染； 在细胞培养液和维持液中加入抗生素（Penicillin, Streptomycin , Amphotericin B），其浓度有原来的1%提高到2%； 生长液要使用胎牛血清，维持液使用小牛血清，如果接完血浆培养24 h后细胞状态不好，可以使用含有2%FBS 的DMEM 作为维持液； 加入胰酶消化时，具体消化时间还要结合所用胰酶中 Trypsin 和EDTA 浓度，细胞生长状态，培养瓶种类等因素； 细胞传代通常按照 1：4 进行，具体还要看细胞密度而定； 采用肝素钠和肝素锂作为抗凝剂，除有抗凝作用以外，还能促进病毒与细胞的结合； 采血时注意要快速，且要与抗凝剂快速混合； 采完抗凝血后要注意及时分离血浆，避免过夜。分离好的血浆可以在-80 保存； 细胞悬液铺在 24 孔板后，要及时（4 h内）加入分离好的血浆； 如果条件具备，最好准备2 个细胞培养箱和2 个超净台，避免交叉污染。E.4 ALV p27抗原检测用E