《翻译水平的调节》PPT课件.ppt

四、翻译水平的调节,遗传密码的性质,通过校正tRNA的方式 校正基因的碱基缺失和插入,为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称。催化DNA链断开和结合的偶联反应，为了分析体外反应机制，用环状DNA为底物。在闭环状双链DNA的拓扑学转变中，要暂时的将DNA的一个链或两个链切断，根据异构体化的方式而分为二个型。切断一个链而改变拓扑结构的称为型拓扑异构酶（top- oisomerase），通过切断二个链来进行的称为型拓扑异构酶（topoisomerase）。属于型的拓扑异构酶，有大肠杆菌的蛋白（-protein，由分子量11万的单个多肽链所成）及各种真核细胞中存在的切断-结合酶（nicking-closing enzyme，分子量约6万5千7万的及分子量约10万的）。型拓扑异构酶，有存在于细菌中的DNA促旋酶、噬菌体T4的拓扑异构酶以及真核细胞中依赖ATP的拓扑异构酶等。,在型拓扑异构酶中，DNA促旋酶可单独催化闭环状DNA产生超螺旋，这是独特的。,(一) 翻译内含子(translational intron),T4DNA拓扑异构酶在ATP存在下，可使超螺旋DNA变成松散的DNA，其中有DNA双链的断裂，链的旋转，再缝合。全酶由三种亚基六个蛋白质分子组成，分别由基因39、基因52和基因60编码。基因39编码的亚基有520个氨基酸，ATP酶活性。基因52编码的亚基有441个氨基酸，松散DNA超螺旋。基因60编码的亚基有160个氨基酸，结合各亚基，协调功能。这三个亚基的蛋白质顺序已分析清楚。已经获得基因39、52、60的DNA克隆，并在大肠杆菌中高效表达蛋白质。,T4 DNA topoisomerase: a new ATP-dependent enzyme essential for initiation of T4 bacteriophage DNA replication Nature 281, 456 - 461 (11 October 1979) Leroy F. Liu, Chung-Cheng Liu & Bruce M. Alberts Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, California 94143,Nucleotide sequence of a type II DNA topoisomerase gene. Bacteriophage T4 gene 39 Nucleic Acids Research, 1986, Vol. 14, No. 19 7751-7765 Wai Mun Huang Department of Cellular, Viral and Molecular Biology, University of Utah Medical Center Salt Lake City, UT 84132, USA,The 52-protein subunit of T4 DNA topoisomerase is homologous to the gyrA-protein of gyrase. Nucleic Acids Res. 1986 September 25; 14(18): 73797390. W M Huang,对基因60的核苷酸序列分析后，难以排出合适的阅读框架，与它表达产物蛋白质的氨基酸顺序对照，发现在第46位甘氨酸和第47位亮氨酸密码子之间，有50个核苷酸插入，其中紧跟第46位甘氨酸密码的是一个终止密码TAG。 DNA有义链 5GGCTAG CTC3 mRNA 5GGCUAG CTC3 蛋白质序列 甘氨酸 亮氨酸 第46位 第47位,在细胞中，mRNA中是否也有这段插入序列？,人工合成基因60编码区的30聚多核苷酸和插入序列的30聚多核苷酸作为两种探针，分别检测T4感染细胞的RNA，杂交分析，两种探针完全给出相同的杂交图谱一条带，实际上细胞中只有一种RNA，没有发现有mRNA剪切加工的现象。对细胞中基因60的mRNA作核苷酸序列分析，都发现有50核苷酸插入序列的存在。,RNA电泳,转移,杂交分析,正极,负极,共三条带,编码区探针,插入序列探针,DNA转录,剪接,+,无论哪种探针都只有一条相同的带，说明细胞中只有一种RNA,普遍性：,1. 将50个核苷酸序列插入到LacZ的适当编码序列内，在翻译过程中，大肠杆菌核糖体同样可以跳过这个非翻译序列，产生完整的半乳糖苷酶。 2. 在酵母表达系统中，酵母核糖体也能跳过这段序列，产生完整的蛋白质。,意义：,设想在翻译水平上调控，形成不同的二级结构。,Evaluation of the mutations suggests 5 requirements for efficient ribosome hopping: Amino acid residues 17 to 32 of the nascent peptide Termination codon right after codon 47 A short hairpin at the take-off site Identity between codons 47 and 48 A 50 nt spacing between codons 47 and 48,Science, Vol 239, Issue 4843, 1005-1012, 1988 A persistent untranslated sequence within bacteriophage T4 DNA topoisomerase gene 60 WM Huang, SZ Ao, S Casjens, R Orlandi, R Zeikus, R Weiss, D Winge, and M Fang Department of Cellular, Viral and Molecular Biology, University of Utah Medical Center, Salt Lake City 84132,abstract,A 50-nucleotide untranslated region is shown to be present within the coding sequence of Escherichia coli bacteriophage T4 gene 60, which encodes one of the subunits for its type II DNA topoisomerase. This interruption is part of the transcribed messenger RNA and appears not to be removed before translation. Thus, the usual colinearity between messenger RNA and the encoded protein sequence apparently does not exist in this case. The interruption is bracketed by a direct repeat of five base pairs. A mechanism is proposed in which folding of the untranslated region brings together codons separated by the interruption so that the elongating ribosome may skip the 50 nucleotides during translation. The alternative possibility, that the protein is efficiently translated from a very minor and undetectable form of processed messenger RNA, seems unlikely, but has not been completely ruled out.,安徽省怀远第一中学,敖世洲，1952届校友，研究员(中国科学院上海生物化学研究所学术委员会副主任)，1957年毕业于北京大学生物系。曾兼任中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室副主任、主任，现兼任该实验室学术委员会主任。1993年被评为中国科学院优秀研究生导师。,（二）microRNA,（三）蛋白质合成过程的调节,1.珠蛋白合成调控-eIF2磷酸化对翻译的调控：,红细胞体积很小，直径只有78m，形如圆盘，中间下凹，边缘较厚。它具有弹性和可塑性，在通过直径比它还小的毛细血管时，可以改变形状，通过后仍恢复原形。 正常成熟的红细胞没有细胞核，也没有高尔基体和线粒体等细胞器，但它仍具有代谢功能。红细胞内充满着丰富的血红蛋白，血红蛋白约占细胞重量的32，水占64，其余4为脂质、糖类和各种电解质。,哺乳动物网织红细胞蛋白质合成调控研究得较为详细。 网织红细胞是红细胞成熟前发育的最后阶段，由它合成的蛋白质90以上是珠蛋白。,珠蛋白 铁卟啉,血红素,血红蛋白,血红素与珠蛋白的合成以平行速度进行，如完整细胞中缺铁或网织红细胞内缺血红素，合成蛋白质的速度下降到原来的10。,血红素缺乏造成的影响是生成了一个抑制物血红素调控阻遏物(HCR)。分子量80,000-90,000，含有蛋白激酶的性质，可磷酰化eIF-2，80S起始复合物不能形成， 加入外源的eIF-2或HCR抗体可克服HCR的影响。有一种专一性的磷酸酶可以催化这个逆反应。,2.酵母 eIF-2的磷酸化对GCN4 mRNA翻译起始的激活作用,啤酒酵母的GCN4是一个转录因子，它能特异地结合与许多氨基酸合成酶基因的启动子TGACTC上，诱导基因的转录。 GCN4 蛋白质合成量的增多是由于GCN4 mRNA在翻译时被激活。,上游的AUG起始密码子的存在抑制下游ORF的翻译 在eIF-2正常水平时，上游的每个ORF都能进行翻译，GCN4的翻译几率较少,Model of protein synthesis on circular polysomes and recycling of ribosomal subunits.,在氨基酸饥饿的条件下，磷酸化的eIF-2增多，活化的eIF-2减少，翻译起始复合物的再循环必然受到限制。翻译完uORF1后的核糖体迅速滑过其它uORF，到达GCN4-ORF开始翻译，逃避了其它uORF的抑制。,玉米籽粒颜色,五、翻译后水平的调节,（一）蛋白质的成熟 1. 多余序列的切除 胰岛素原的激活,2. 蛋白质内含子Intein,蛋白质内含子是蛋白质中的一段多肽链，靠自我剪切的方式从前体蛋白中分离出来，同时两端以肽键的方式相连。蛋白内含子又称为内蛋白子。 蛋白外显子又称为外蛋白子（estein）。,特征序列,A、B、C、D、E、F、G六个保守的motif,Ser类型,自我剪切过程,Cys类型,用途,构建表达载体，产生蛋白质。,NEW ENGLAND BioLabs INC. IMPACT-CN System,（二）蛋白质高级结构的正确形成: 分子伴侣,1. Anfinsen的牛胰核糖核酸酶变性复性试验,RNaseA,50年代末完成全序列测定的第一个蛋白质，124个氨基酸，MW12600，4对二硫键。在8mol/L尿素，-巯基乙醇存在时，二硫键被破坏，变为松散结构。透析，除去尿素和-巯基乙醇，再加入氧化剂，则重新恢复构象。,蛋白质自组装(Selfassembly)假说,第一阶段是成核（nucleation)。由于挤压效应或疏水作用，多肽链中的一些小肽段迅速行成螺旋，作为进一步折叠的核心，称为核区。 第二阶段是折卷（collapse)。已成为核的结构，随后散落成为较大的超二级结构单元的集合体，包括一些 -折叠片和-转角的形成。 第三阶段是凝集（condensation)。上述集合体在原子水平上凝集，形成致密的三级结构。,“这个实验出色地证明了蛋白质的功能取决于特定的天然构象，而规定其构象所需要的信息包含在它的氨基酸序列中。” 摘自基础生物化学 （高等教育出版社，2001.7),Christian B. Anfinsen(USA)因此获得1972年诺贝尔生理或医学奖。,问题：,特例 ：RNase的超稳定性。,蛋白质的合成过程： 蛋白质合成中，首先合成N端，再向C端延伸。在水相中，亲水的力量迫使多肽链疏水的基团聚集于内部，亲水基团位于外部。新生肽键的折叠在合成早期业已开始，随肽键的延伸同时进行折叠，形成某种结构。这与一条变形伸展的完整肽键的重折叠的情况是完全不同的。,发现过程,2.Molecular chaperone的发现过程及定义,1962年，意大利生物学家F.M.Ritossa在研究果蝇(Drosophila)的发育时，发现: 当培养果蝇的温度从正常的25上升到32时，幼虫(larvae )细胞中的一些巨型染色体上的新的位点变得异常活跃。研究表明，温度的升高促使一些新基因的表达。这就是热激反应（heat-shock response)的发现。,定义 The molecular chaperone concept. Ellis RJ. Department of Biological Sciences, University of Warwick, Coventry, UK. Molecular chaperones are a ubiquitous family of cellular proteins which mediate the correct folding of other polypeptides, and in some cases their assembly into oligomeric structures, but which are not components of those final structures.,一类相互之间没有关系的蛋白质。它们的功能是帮助多肽结构的其它物质在体内进行正确的非共价的组装，并且不是组装完成的结构在发挥其正常的生物功能的组成部分。,中国科学院生物物理研究所的王志珍院士,分子伴侣帮助新生肽链正确折叠-助人为乐的分子伴侣太太很快出现在需要她尽力而为的场所（新生肽链的折叠，越膜，应激反应等情况），她主动去发现她应该帮助的正在成长的新生肽姑娘（识别折叠中间物），热情地伸出友谊之手（相互作用和结合），并发出警戒之言“不！不！别往哪儿走！“，防止她们误入歧途掉进不可自拔的死亡深渊（防止错误的相互作用导致的无效折叠和不可逆聚集），从而帮助她们沿着朝向正确目标的光明大道前进（有利于有效折叠成功能蛋白的正确折叠途径）。新生肽姑娘健康地成长（正确折叠）。折叠好的蛋白质小姐愉快地，昂首阔步地准备去做自己的贡献（折叠成特定的空间构并获得生物活性的功能蛋白）。,3.分子伴侣的种类,a. 分子内分子伴侣 intramolecular chaperone 体内许多蛋白质都以前导肽的前体形式合成，前导肽在蛋白质折叠中具有分子伴侣的功能。 b. 分子伴侣,分子伴侣的分类和分布,1) 伴侣素家族（chaperonin, Cpn） Cpn 家族是具有独特的双层 7-9 元环状结构的寡聚蛋白（ Hemminngwen 1988; Cheng 1989 ），它们以依赖 ATP 的方式促进体内正常和应急条件下的蛋白质折叠。 Cpns 又分为两组： GroEL(Hsp60) 家族和 TriC 家族。 GroEL 型的 Cpns 存在于真细菌、线粒体和叶绿体中，由双层 7 个亚基组成的圆环组成，每个亚基分子量约为 60Ku 。它们在体内与一种辅助因子，如 E. coli 中的 GroES ，协同作用以帮助蛋白折叠。除了叶绿体中的类似物外，这些蛋白是应急反应诱导的。人们对 GroEL 和 GroES 的结构、功能及其作用机制做了十分详尽的研究。 TRiC 型（ TCP-1 环状复合物）存在于古细菌和真核细胞质中，由双层 8 或 9 元环组成，亚基分子量约为 55K ，与小鼠中 TCP-1 尾复合蛋白（ TCP-1 tail complex protein ）有同源性。这种 Cpn 没有类似 GroES 的辅助因子，而且只有古细菌中的成员有应急诱导性；,The structure of E.coli GroEL heat shock protein (hsp). There are 14 subunits of the GroEL. Attached to the apical domain is the GroES. The apical region is also capable of polypeptide binding. The lower region, (circled, bottom) is concerned with ATP binding.,GroEL/GroES 复合体的高级结构,2) 应激蛋白70家族(Stress-70 family) 又称为热休克蛋白70家族（Hsp70 family），是一类分子量约70Ku的高度保守的ATP酶，广泛地存在于原核和真核细胞中，包括大肠杆菌胞浆中的DnaK/DnaJ，高等生物内质网中的Bip、Hsc1、Hsc2、Hsc4或hsc70，胞浆中的Hsp70、Hsp68和Ssal4p，线粒体中的Ssclp、Hsp70等。在细胞应急和非应急条件下的蛋白质代谢，如蛋白质的从头折叠（de novo protein folding)、跨膜运输、错误折叠多肽的降解及其调控过程中有重要的作用。在体内，Hsp70家族成员的主要功能是以ATP依赖的方式结合未折叠多肽链的疏水区以稳定蛋白质的未折叠状态，再通过有控制的释放帮助其折叠（Hartl 1996）。,3) 应激蛋白90家族(Stress-90 family) 即热休克蛋白90家族（Hsp90 family），分子量在90Ku左右，包括大肠杆菌胞浆中的HtpG，酵母胞浆中的Hsp83与Hsc83，果蝇胞浆中的Hsp83，以及哺乳类胞浆中的Hsp90与内质网中的Grp94（Erp90或内质网素endoplasmin）等。Hsp90可以与胞浆中的类固醇激素受体结合，封闭受体的DNA结合域，阻碍其对基因转录调控区的激活作用，使之保持在天然的非活性状态，但hsp90的结合也使受体保持着对激素配体的高亲和力。hsp90还与Ras信号途径中许多信号分子的折叠与组装密切相关，主要是hsp90的结合与解离，介导了这些分子在非活性形式与活性形式间的转化。如转化型酪氨酸激酶pp60v-src或在一定条件下，从hsp90等与之形成的复合物中释放，才能转位至胞膜，行使激酶的活性功能。Casein(CKII)和el/f-2a是两种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其中Casein(CKII)与细胞生长和细胞周期有关，el/f-2a激酶则调节蛋白质合成，两者均可与hsp90及其他分子伴侣形成复合物。除hsp90以外，其他分子伴侣如hsp70,PPIs等都影响了受体分子的激活过程。,4) 其他种类的分子伴侣 包括核质素、T受体结合蛋白(TRAP)、大肠杆菌的SecB和触发因子（trigger factor）及PapD、噬菌体编码的支架蛋白（scaffolding proteins）等。分子伴侣不仅与胞内蛋白的折叠与组装密切相关，影响到蛋白质的转运、定位或分泌；而且与信号转导中的信号分子的活性状态与活性行为相关连，具有重要的生理意义（Bohen 1995, Pratt 1997）。,c. 酶 1) 肽基脯氨酸顺反异构酶 Peptidyl prolyl isomerases (PPIases) accelerate cis-trans isomerization of Pro residues during protein folding.,2) 蛋白质二硫键异构酶? 真核生物的PDI主要位于内质网，细菌中的类似物是Dsb家族，位于细菌外周质（periplasm），通过催化巯基与二硫键的交换反应，从而催化蛋白质二硫键的形成、还原（断裂）或重排（异构化）。在蛋白质折叠过程中，主要催化含有二硫键的膜蛋白或分泌蛋白的正确折叠。,4.分子伴侣的作用机制,Example： Chaperone rings in protein folding and degradation Arthur L. Horwich , Eilika U. Weber-Ban, and Daniel Finley PNAS Vol. 96, Issue 20, 11033-11040, September 28, 1999,返回,Protein folding within the ER,5.分子伴侣的功能,蛋白质和新生肽的折叠模型,新生肽链,未折叠肽链,复合物,中介,降解产物,正常功能的蛋白质,Aggregates,由于许多蛋白质的高级结构的形成需要分子伴侣，所以其生物学功能广泛。 a. -crystallin 眼睛晶状体的主要结构蛋白，与其它晶状体蛋白结合以防止它们老化和沉淀，保持晶状体澄清和必要的折光度。 b. Hsp60. Hsp70 帮助蛋白质进入线粒体。,c. Sec B E.coli中维持新生肽的疏松状态使其可以穿过质膜而运输。 d. Pap D 位于细菌间质中，与P鞭毛蛋白亚基结合防止它们在周质中聚合，从而促进正确组装P鞭毛。 e. Rb. 视网膜母细胞瘤抑制基因是某些转录因子的分子伴侣。,疯牛病、老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤、白内障等等都是“折叠病”。,正在火化病牛以防止“疯牛病”的传播,返回,Prion,蛋白质合成的原料： 蛋白质氨基酸,第二十一种蛋白质氨基酸： 硒代半胱氨酸 Selenocysteine（Sec ）,Several enzymes (for example, glutathione peroxidase谷胱甘肽过氧化酶(GSHPx) , tetraikiodothyronine 5 deiodinase and formate dehydrogenase) contain the unusual amino acid,由UGA编码Sec，在动物(猫、牛和鼠等) 和大肠杆菌中发现,甲状腺激素,甲状腺分泌甲状腺激素，调控体内各种化学反应的速度（代谢速率）。甲状腺通过两种方式影响机体代谢率：刺激几乎所有组织合成蛋白质；增加细胞耗氧量，细胞负担加重，器官代谢加快。,大脖子病,甲亢,重庆男子患甲亢 手脚现异常,双手双脚离奇肿胀，超过常人的三倍，且皮肤表面皱皱巴巴的像熟透的“柑橘皮”。昨日，经新桥医院内分泌科诊断，铜梁县永清乡的杨斌（化名）因患甲亢，引发十分罕见的并发症，导致手脚如同“熊掌”。,甲状腺激素存在方式有两种：一种是甲状腺素（T4），在甲状腺内产生，存在时间短，对机体代谢率影响 较小。T4在肝脏及其他脏器转化为有代谢活性的另一种形式甲状腺激素，叫三碘甲状腺原氨酸（T3）。约80有活性的激素在T4的转化过程中产生，剩余 20由甲状腺自身产生。,T4的脱碘反应是由脱碘酶的催化完成,I型脱碘酶的cDNA序列和蛋白一级结构,三种脱碘酶都是含硒酶,脱碘机理,第二十二种蛋白质氨基酸：,甲烷菌分解甲氨(CH3NH2)，而产生甲烷 。,October 16, 2002 Identification of the 22nd genetically-encoded amino acid in a methanogen methyltransferase G. Srinivasan, T.K. Ferguson, C.M. James, B. Hao, W. Gong, J. Krzycki, and M. Chan Ohio State University, Columbus, Ohio,甲胺甲基转移酶,Proteins have long been known to be composed of only 20 building blocks, called amino acids. But about 25 years ago, scientists discovered an additional, 21st amino acid, called selenocysteine. Now, two groups of researchers led by biochemist Michael Chan and microbiologist Joseph Krzycki, both of The Ohio State University in Columbus, have identified the 22nd amino acid in an enzyme, called methyltransferase, which breaks down methylamine (CH3NH2) in methane(CH4)-producing microbes called methanogens, leading to the production of methane. The scientists call this new amino acid pyrrolysine.,吡咯赖氨酸：Pyl,密码子为UAG,吡咯赖氨酸在产甲烷菌的甲胺甲基转移酶中发现,是目前已知的第22种参与蛋白质生物合成的氨基酸,与标准氨基酸不同的是,它由终止密码子UAG的有义编码形成.与之对应的在产甲烷菌中也含有特异的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)和吡咯赖氨酸tRNA(tRNAPPy1).tRNAPy1具有不同于经典tRNA的特殊结构.产甲烷菌通过直接途径和间接途径这两种途径生成吡咯赖氨酰-tRNAPy1(Pyl-tRNAPy1),它还可能通过mRNA上的特殊结构以及其他还未发现的机制,控制UAG编码成为终止密码子或者吡咯赖氨酸。,相关基因,pylT：编码了一特殊的tRNACUA 。 pylS：编码一种合成酶(LysRS) ，能将赖氨酸结合到 tRNACUA 上形成赖氨酸氨酰-tRNACUA 。 pylB 和pylC：赖氨酸氨酰- tRNACUA 被修饰为吡咯赖 氨酸氨酰- tRNACUA 。 翻译时吡咯赖氨酸氨酰-tRNACUA 携带的吡咯赖氨酸被结合到蛋白质链。过程中并没有显示本应出现的终止翻译的（UAG）作用。,1. Hao, B., W. Gong, T. Ferguson, C. James, J. Krzycki, and M. Chan. “A New UAG-Encoded Residue in the Structure of a Methanogen Methyltransferase”, Science, 2002, 296, 1462-1466. 2. Srinivasan, G., C. James, and J. Krzycki “Pyrrolysine Encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding Specialized tRNA”, Science, 2002, 1459-1462.,还可不可能产生 新的蛋白质氨基酸？,需要哪些条件？,氨酰tRNA合成酶,Mg2+ AA+ tRNA+ATP=氨酰-tRNA+AMP+PPi,tRNAGln,Gln-tRNA synthetase,Amino acid arm,Anticodon arm,ATP,Crystal structure of Gln-tRNA synthetase complexed with its cognate tRNA,会产生更多的蛋白质氨基酸吗？,对细胞或生物有哪些影响？,有哪些用途？,美国斯克里普斯研究所和加利福尼亚伯克利分校的研究小组通过改变大肠杆菌的基因，使大肠杆菌能够产生一种叫做“对氨苯丙氨酸”的新型氨基酸。,（三）真核生物蛋白质的定向输送,运往线粒体中的蛋白质,（四）蛋白质降解的调节： 泛肽蛋白酶系统,细胞周期蛋白的消失,Proteins differ markedly in their half lives and are targeted for destruction,Damaged proteins are usually quickly removed by controlled degradation; Enzymes important in metabolic regulation usually have short lives; Proteins are degraded by ATP-dependent cytosolic systems in all cells; Ubiquitin, a extremely well conserved 76-residue protein, tags proteins for destruction in eukaryotic cells by the action of three enzymes (E1, E2 and E3);,2004年诺贝尔化学奖 得主,1.哺乳动物泛肽的结构与特征 MQIVFKTLTGKTITLEPSDTIENVKAK IQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTL SDYNIQKESTLHLVIRLRGG,2. 泛素蛋白酶作用过程,1)在ATP存在下，泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme)E1催化泛素羧基末端腺苷酸化，然后这个活化的泛素以羧基端的甘氨酸(G)与E1上的一个半胱氨酸之间形成硫酯键，这是一个高能键。2)在E1和泛素偶联酶(ubiquitin-confugating enzyme)EZS家族之一的催化下，将泛素仍以硫酯键连接于E2上，接着，在E2和泛素蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligase)E3的催化下，泛素从E2转移到降解的蛋白质的赖氨酸上形成酰胺键。这种泛素与蛋白质的复合物是一个蛋白酶复合体的作用目标，这个蛋白酶复合体由多条肽链组成，降解泛素蛋白酶复合物为多肽，降解过程可能需要ATP供能，最后由泛素水解酶水解时放出游离的泛素再参加下一次循环。,第二节 酶的活性调节,一、变构效应的调节 （一）变构酶的特性与结构 变构酶特点： a. 有多个亚基 b. 有四级结构 c. 除了有可以与底物结合的活性中心外，还有可以结合调节物的别构中心 d. 酶促反应动力学不遵循米氏方程,（三）变构酶调节催化活性的机理(略) （四）变构酶举例：,a. 大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶ATCase. 6个调节亚基R，上面有结合ATP和CTP部位；6个催化亚基C，具催化活性。 ATP激活剂，CTP抑制剂。,Catalytic trimers are green. Regulatory dimers are red.,（二）变构酶的酶促反应动力学,根据结合调节物后构象的变化对酶与底物结合的影响，分为正协调效应与负协调效应。 a. 非调节酶 b. 正协同别构酶：在中等或较低底物浓度下，底物浓度发生较小的变化引起酶促反应速度有较大的变化，可以灵敏的调节酶促反应速度。 c. 负协同别构酶：在很宽的底物浓度范围内，酶促反应速度变化不明显，即对底物浓度变化不敏感。,b. 3磷酸甘油醛脱氢酶：负协同效应别构酶代表,此酶具有四个亚基，可以和四个NAD结合，但结合常数不同。酶结合NAD后，发生构象变化。NAD和酶结合的解离常数很小，因此虽然底物NAD浓度很低，也能顺利地和酶结合。但是当NAD浓度升高时，酶结合了两个NAD之后，再结合第三、第四个NAD就不那么容易。也就是说这时候再要提高酶反应速度是较难的，需要浓度大大提高才行。在一定的底物浓度范围内，底物浓度变化不足以影响酶反应速度。这就是负协同别构酶对底物浓度变化的不敏感性。,D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (holo form) (E.C.2) complexed with NAD (red),3-磷酸甘油醛脱氢酶与NAD结合的解离常数(平衡透析测定),解离常数(mol/L) 虾肌 兔肌 K1 510-9 10-10 K2 510-9 10-9 K3 610-7 310-7 K4 1.310-6 2.610-6,在有机体中有许多需要NAD的代谢途径，NAD+参与许多的反应，其浓度波动大。糖酵解是生物体内重要的代谢过程，速度要求相对稳定，在供氧不足的情况下，它仍需以一定的速度稳定的进行反应。因为3-磷酸甘油醛脱氢酶为此过程的负协同别构酶， 对底物NAD浓度变化不敏感，所以当NAD浓度很低(缺氧情况下)，其它需要NAD的代谢反应都随之减缓时，酵解过程仍然能以一定的速度顺利的进行。由此可以看到负协同效应别构酶的重要生理功能。,二、同功酶的调节,（一）同功酶的定义及形成 同功酶(isoenzyme)是能催化相同的化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构、理化作用不完全相同的一组酶。它们普遍存在于动植物和微生物中，至今已发现了数百种之多，同功酶可存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织，甚至同一组织、同一细胞中。 初级同功酶： 酶蛋白由不同的基因编码而产生。 次级同功酶：由一个酶蛋白的基因在表达过程中经过不同的加工和修饰所产生。,（二）意义：,1. 生物不同部位的生理状况 2. 在发育过程中，适应不同的发育阶段 3. 分枝代谢的调节,三、酶分子的共价修饰,在某种酶的催化下，某一基因(磷酰基或腺苷酰基)以共价键与酶分子相连，使酶活性发生改变。 主要指蛋白质的磷酸化与脱磷酸化,蛋白质的共价修饰,乙酰化：N末端的氨基和赖氨酸的氨基 甲基化：氨基、氨基：精氨酸的胍基以 及C末端的羧基和侧链羧基上 磷酸化：丝氨酸、苏氨酸、 酪氨酸的羟基上 泛素化：氨基和氨基上 糖基化： N糖苷链连接于天门冬酰胺的酰胺 基上 O糖苷键：丝氨酸、苏氨酸、羟赖 氨酸、羟脯氨酸的羟基上 S糖苷键：半胱氨酸的巯基,（一）概念及特性,蛋白质的磷酸化与脱磷酸化过程是生物体内存在的一种普遍的调节方式，几乎涉及所有的生理及病理过程，如糖代谢、光合作用、细胞的生长发育、基因表达、神经递质的合成与释放、甚至细胞的病变，在细胞的信号传递过程中有着极其重要的作用。 蛋白质的磷酸化是指由蛋白激酶催化的把ATP或GTP的位的磷酸基团转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆反应由蛋白磷酸酶催化，称为脱磷酸化。,特 性：,ATP在大多情况下是磷酸基团的供体。蛋白质中被磷酸化的氨基酸残基主要是Ser或Thr，有些蛋白激酶可磷酸化酪氨酸。被磷酸化的氨基酸残基可以有多个。 多数蛋白激酶表现出一定的底物特异性，但很少有绝对特异性。一种蛋白质可作为几种蛋白激酶的底物和一种蛋白激酶有多种底物的情况是很常见。但一般情况下各类蛋白激酶都有它们的适宜的底物。,Glucose (red), AMP (dark blue, allosteric activator), pyridoxal phosphate (PLP, B6 derivative, light blue), and ser14 (yellow),Glycogen phosphorylase,底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基附近的氨基酸组成和顺序常常构成被蛋白激酶辨认的特殊区域。例如依赖cAMP的蛋白激酶(PKA)需要底物被磷酸化的丝氨酸或苏酸残基附近(N端方向)由碱性氨基酸即Arg 或 Lys 残基，如Arg-Arg-X-Ser/Thr-x 这样的顺序，其中X可以是任何氨基酸残基。在丝氨酸/苏氨酸类型的蛋白激酶中，由第二信使调节的蛋白激酶都需要底物具有类似的结构，而这类蛋白激酶中非信息依赖性的酪蛋白激酶则需要底物被磷酸化的氨基酸残基C端附近要有酸性氨基酸残基，即具有类似X-X-Ser/Thr-X-Glu- 的结构顺序。酪氨酸型的蛋白激酶有时需要被磷酸化氨基酸残基附近要有酸性氨基酸，但是不是所有这类蛋白激酶都需要这样的底物结构尚不清楚。,（四）蛋白质磷酸化的意义,1催化蛋白质磷酸化的蛋白激酶的活性受胞内信使cAMP， Ca2+，DG等的调控，也即其活性主要受胞外信号的间接调节，是细胞对外界的信号作出反应，所引起的细胞效应，许多是持久的，如细胞的分裂分化等过程。,2调节细胞内已存在的酶的“活性酶量”。,与酶的重新合成与分解相比，这种方式是细胞对外界刺激作出迅速反应。 肌肉中，糖原磷酸化酶 糖元 G-1-P 糖元利用的第一步，也是糖元降解利用的主要调节机制。 动物体内，两种状态a. (四聚体，激活) b. (二聚体，失活),3对外界信号具有级联放大作用。 胰高血糖素升高血糖的机理。,4蛋白质磷酸化与脱磷酸化几乎涉及所有的生理过程，功能上具有多样性。除了其主要功能之一调节酶的活性以外，从磷蛋白在胚胎发育中的营养作用到细胞的生长发育、分裂分化调控、基因表达甚至癌变，都有这一过程的参与。调节的对象，可以是酶类、功能蛋白、结构蛋白、各种受体等。最近人们还发现一种非常有趣的现象，在某种情况下，已知具有一定生理功能的某些蛋白质可被磷酸化，但磷酸化的结果对其功能并没什么明显影响，这种情况被称为“哑态”磷酸化，后来发现，这些被磷酸化的蛋白质常常是蛋白水解酶的“靶子”而被降解。因此磷酸化作用还可能参与活性分子的“灭活”而作为某些生理过程的调节方式。,5蛋白激酶的自身磷酸化 (autophosphorylation),几乎所有的蛋白激酶都可以进行自身的磷酸化作用，即某种蛋白激酶可以利用它自身作为底物。这种作用可以发生在酶分子之间，两个酶分子之间可以相互磷酸化；也可发生在分子的内部，即一个酶分子的催化部位可磷酸化同一分子的其它部位。,最近几年研究证明：自身磷酸化是蛋白激酶调节其活性的重要方式。例如，磷酸化酶激酶自身磷酸化后其基础活性增高；依赖cAMP的蛋白激酶(型)的自身磷酸化可以影响其调节亚基与cAMP的结合与解离；胰岛素受体具有蛋白激酶的功能，自身被磷酸化后其活性不再依赖胰岛素。虽然对于这些自身磷酸化所引起的蛋白激酶特性的变化的具体调节机制和生理功能在多数情况下还不很清楚，但无疑这一特性为蛋白激酶所参与众多的生理过程提供了一种特殊而有效的自我调节方式。,蛋白质组研究简介,基因组(Genome)： 是指一个细胞或病毒所包含的全部基因。 是基因组计划的工作对象。,一、蛋白质组学的定义及研究内容,蛋白质组(Proteome)一词最早由澳大利亚学者 Wilkins等于1994年提出，指的是由一个基因组geneome或一个细胞、组织表达的所有protein。 蛋白质组学(proteomics)是研究在特定时间或环境下某个细胞或某种组织的基因组表达的全部蛋白质。,蛋白质组学的真正含义在于: 它不是按照传统的方式孤立地研究某种蛋白质分子的功能,而是应用各种蛋白质组学技术研究某种蛋白质在复杂的细胞环境中的功能。蛋白质组学旨在列出全部蛋白质的细目,弄清每一个蛋白质的结构和功能及蛋白质群体内的相互作用,对比在疾病和健康状态下它们的表达水平的变化。,与以往的经典蛋白质化学研究相比，蛋白质组的研究对象不再是单一或少数蛋白质，而是着眼于全面性和整体性，需要研究体系内所有蛋白质组分的物理、化学、生物学性质与功能，最终获得每个蛋白质组分的性质功能、 表达变化及翻译后加工的大规模信息。,蛋白质组与基因组的关系,蛋白质有自身特有的活动规律，如动态修饰、加工、转运定位、结构形成、代谢等，均无法从基因组水平上的研究获知。蛋白质构象病更难于只靠DNA序列来解释。,序列所提供的信息仅仅是一种静止的资源，而细胞的生命活动是通过各种蛋白质来实现的一种动态过程。一个机体内所有不同的细胞都共享同一基因组，然而同一个机体的不同细胞和不同组织却有不同的蛋白质组，而且机体在不同发育阶段，直至最后消亡的全过程中蛋白质组也在不断变化。因而蛋白质组要比基因组复杂得多。,正如Raj Parekh 所说的那样： “在一个细胞里，基因组能告诉我们理论上有哪些蛋白质会被表达，mRNA 能告诉我们哪些蛋白质可能被表达，而蛋白质组却告诉我们蛋白质表达的时间、地点、种类和数量。”,二、蛋白质组学的研究内容 1. 细胞或组织内蛋白质的表达模式及修饰（表达蛋白质组学）； 2. 蛋白质的序列和高级结构（结构蛋白质组学）； 3. 蛋白质的胞内分布及移位（细胞图谱蛋白质组学； 4. 蛋白质的功能模式（功能蛋白质组学）：蛋白质与蛋白质及其与其他分子的相互作用；,三、蛋白质组学研究的程序,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,蛋白质组学研究的程序,蛋白质组研究的核心用于分离的双向电泳(2 -DE),第一向：等电聚焦,charge,size,第二向：SDS-PAGE电泳,Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their size. Smallest proteins travel the furthest distance,More Data with Narrow Range IEF,pH 3-10,pH 3- 6,pH 5- 8,pH 7-10,IPG Effective Strip pH Overlapping Length Range Gel Area 24 cm 3-10 56 cm 18 cm 3-10 44 cm 17