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第八章 污染物生物毒性和致突变性的微生物学监测方法,第一节 污染物生物毒性的微生物监测方法 第二节 污染物致突变性的微生物监测方法,生物测试（Bioassay）的概念： 指系统地利用生物的反应测定一种或多种污染物或环境因素单独或联合存在时所导致的影响或危害。 注释1：所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统各级水平上的反应。 注释2：生物测试不同于常规的物理、化学检测。前者能够测定污染物对生物机体的影响，而后者只能测定污染物的浓度。 例如：通过水污染的生物测试可获得以下数据：各种环境因素如DO、pH、温度、混浊度等对生命的有利以及不利的浓度或强度；污染物对受测生物的毒性；各种水生生物对污染物的相对敏感性；废水所应处理的程度；允许的污染物排放浓度等。,毒性试验常用参数,致死剂量或致死浓度（Lethal Dose， Lethal Concentration） 绝对致死剂量或致死浓度（LD100、LC100） 半数致死剂量或浓度（LD50、LC50） 最小致死剂量或浓度（MLD、MLC） 最大耐受剂量或浓度（LD0、LC0 ） 最大无作用剂量（Maximum Noeffect Level） 每日容许摄入量（Acceptable Daily Intake） 最高容许浓度（Maximum Allowable Concentration） 毒作用带 急性毒作用带（Acutetoxic Effect Zone） 慢性毒作用带（Chronic toxic Effect Zone ）,半数效应浓度（EC50）和半数抑制浓度（IC50）:影响或抑制微生物正常生理指标值50%所需的待测物浓度。,检测毒性的手段：动物检测、微生物检测 动物检测急性毒性：研究化学物质大剂量一次染毒或24小时内多次染毒动物所引起的毒性的试验。 其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。 急性毒性试验类型 哺乳动物急性毒性试验 水生生物急性毒性试验 蚯蚓急性毒性试验 观察时间为2周，以半数致死浓度LC50表示。,微生物检测选择一项或几项生理指标为指征，根据代谢物影响或抑制这些指征的程度来判断毒性的强度。 评价指标多为EC50或IC50,一、发光细菌细菌生物发光抑制试验 细菌生物发光的生物学机制： FMNH2 + RCHO +O2 FMN + H2O + RCOOH + 光 420-670nm的可见光 细菌生物发光抑制试验是国际标准化组织认可，也列为我国水质评价的国家标准方法。,第一节 污染物生物毒性的微生物监测方法,（一）试验原理 毒物细菌荧光素酶活性或细胞呼吸受到抑制发光能力减弱（比例关系） 光电测定装置测出发光强度的变化 菌株：应用最多的是明亮发光杆菌 美国贝克曼 (Beckman) 公司制造的微量毒性分析仪就是一种发光细菌检测仪，操作极为方便，测定一个样品不到半小时，所得结果与鱼类毒性试验一致。（Microtox）,国际通用，使用最为广泛的微生物学检测方法。 冻干菌种：筛选、培养的明亮发光杆菌，真空冷冻干燥（加保护剂，缓冲物质，NaCl等），-2025C保存。,（二）试验方法 菌种复苏：2%NaCl，悬液 样品处理：系列稀释，调pH6-8，渗透压2%NaCl 毒性测定：测试管加入样品和菌液，以苯酚作阳性有机毒物对照，以ZnSO4.7H2O作阳性无机毒物对照，蒸馏水为阴性对照。15oC培养5min或15min。光量抑制百分率： （阴性对照组指标值-实验组指标值） 阴性对照组指标值 通过回归方程计算IR为50%时的样品剂量，IC50 质量控制：同一剂量平行管间的发光强度差异值小于20%，苯酚和硫酸锌的IC50有一定范围。,x100%,IR=,（三）方法评价 与传统鱼类96h毒性试验相比具有良好的一致性。 1991年Diane对100种化学物质的毒性测试结果表明两者的相关系数达0.85。 可以根据细菌生物发光试验的发光抑制率进行毒性分级。 各实验室间结果的重现性好 可用于生物传感器分析,国际标准化组织将该方法作为检测化合物或废水毒性的标准方法之一（ISO 9509）。 （一）试验原理 毒性污染物抑制硝化作用的酶类，导致对底物的利用能力或产物的生成量下降。通过测定底物或产物的变化来检测毒性作用的程度。 利用亚硝化单胞菌或硝化杆菌属，或用活性污泥。,二、硝化细菌硝化作用抑制试验,（二）试验方法（以硝化杆菌属为例） 增殖细菌至108个/ml。 加入菌液、NaNO2溶液及样品（不同浓度），以蒸馏水为对照。 培养（30oC4h)、检测NO2- 比较样品组与对照组硝化作用强度，可得IC50 与Microtox灵敏度相当，与鱼类毒性试验结果的相关性为0.45。,美国国家环保局认可的毒性测试方法。 （一）实验原理 藻类对水体污染反应十分敏感。毒物抑制光合作用，藻类生长量减少。常用硅藻、栅藻、小球藻。 （二）试验方法 繁殖藻种 配制培养基，灭菌。加入待测物，接种。 培养。恒温（28-30C），光照。 测定生长量（或其他指标），绘制生长曲线。 计算最大生长率。（max） （三）结果与评价,三、藻类生长抑制试验,又称为微型生物群落监测法，广泛用于水环境的毒性监测与评价。微生物包括细菌、真菌、原生动物、藻类及小型轮虫。国家标准：水质微型生物群落监测 PFU法( (GB/T 12990-91) （一）试验原理 正常条件下自然水环境的微型生物群落种类、分布、构成有一定规律，外界环境因素的干扰下，群落的平衡被破坏，结构特征也随之变化。通过分析微型群落结构和功能参数，判断水环境的质量状况或污染物质的毒性特征。检测结果有很强的生态学意义。PFU法是在群落水平上的,是较物种水平、种群水平更高的,因此它能提供较大的环境真实性。,四、原生动物微尺度群落级毒性试验,最常用的方法是PFU（聚氨酯泡沫塑料块）法。 聚氨酯泡沫塑料块的孔径100-150um，微型生物可以进入其内，能收集到85%的种类，具有环境真实性。一定时间内，原生动物种群构成会达到平衡，而有害物会破坏这一平衡，比较试验组和对照组的群落结构和功能参数，即可评价水体质量与污染程度。,（二）试验方法与评价 把PFU分别浸入对照水体和调查水体，不同时段后，挤出液体，对原生动物鉴定和计数。 PFU中微型生物的结构与功能参数： 异养性指数（HI）=微型生物灰份量/叶绿素a量 原生动物群落多样性指数（d）=（S-1）/lnN (S为原生动物种类数，N为10ml挤出液中原生动物个数） T90 ：达到90%Seq所需的时间（Seq：平衡时原生动物种数） G:原生动物群集速度常数 评价：污染程度高，S、d降低,严重污染的水域中，原生动物的群集速度亦很低，随着水质的清洁程度提高，原生动物的群集速度亦迅速提高。溢流口24小时内仅群集了3种耐污鞭毛虫。而通惠河沿岸的站点，如24小时内，双桥站点群集了19种，东关站点群集了33种，对照站点温榆河群集了37种。,检测待测物的毒性（种类损伤法）： 清洁水体中浸泡的PFU挤出液（接近平衡期的、未成熟的群落。未成熟群落要比成熟群落对污染的毒性反应敏感得多）混合不同浓度的待测物，培养一定时间后镜检原生动物种数，计算待测物影响原生动物种数的EC50（median effect concentration ，半数效应浓度）,（一）脱氢酶活性试验 原理： 脱氢酶作用下，无色的氯化三苯基四氮唑（TTC）受氢后变为红色的三苯甲基（TF），分光光度计485nm处比色，通过标准曲线求的TF产生量，计算脱氢酶活性。可以得出待测物的EC50.,五、活性污泥毒性检测法,（二）呼吸抑制试验 有毒物抑制微生物呼吸作用，使耗氧量和CO2的产生量下降。检测化合物和废水毒性。 瓦勃氏呼吸仪测定消耗的氧量： 碱溶液吸收CO2，反应瓶中压力的降低完全是氧消耗的结果。 溶解氧电极测定耗氧量： 瓶塞上的溶解氧电极记录溶解氧； 相对耗氧速率=污泥的呼吸好氧速率/内源性呼吸好氧速率x100%,优点： 简便 灵敏 快速 经济 缺点： 检测结果有一定范围的变异性； 不能完全代替哺乳动物毒性试验。 适用： 快速筛选大批量样品用细菌生物发光抑制试验， 废水处理影响效果用活性污泥毒性检测法， 评价水质的生态学特征用微尺度群落级毒性试验。,微生物学检测方法的评价,一、基因突变试验 （一）鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体试验（Ames试验） 1、原理 野生型his+ 营养缺陷性his+ 致突变物可使该菌的基因发生回复突变。 美国Ames教授1975年正式建立的方法,第二节 污染物致突变性的微生物检测方法,正向突变,回复突变,试验菌株： 曾推荐的5株：TA1535、 TA1537、 TA1538、TA98、TA100 83年修订之后：TA97、TA98、TA100、TA102 赋予其他附加突变： uvrB突变：失去DNA切割修复能力，敏感性增加； rfa突变：脂多糖屏障却失，大分子透入； 组入某些质粒提高回变能力。 后来一套6株组氨酸缺陷型菌株：TA7001、 TA7002、 TA7003、 TA7004、 TA7005、 TA7006.方便检出碱基的变异。 每次试验可使用一种或几种菌株，只要有任何一株发生大量的回复突变，即为阳性结果。,哺乳动物微粒体酶： 微粒体中含有混合功能的氧化酶系； 有降解作用：把化学物变成低毒或无毒物排出； 有激活作用：使化学物变成具有亲电子性质，导致毒性增强，成为致突变物或致癌物。 哺乳动物微粒体酶系统（简称S9混合液）：从肝匀浆中制取； 加入S9混合液使体外测试条件更接近于人体内代谢条件。,2、试验方法 纸片点试法： 基础培养基+菌液+S9+表层培养基 纸片蘸取待测物至于培养皿中间 培养37oC,48h,观察结果。 长出密集菌落的为阳性，只长出少量散在菌落的为阴性。 平皿掺入法：最高的诱发回变菌落数为自发回变菌落数的2倍或以上属阳性结果。,3、应用与评价 175种已知致癌物进行试验，发现157种为阳性，阳性吻合率90%；阴性吻合率87%。 初筛报警手段。 已被我国食品安全毒理学评价程序、农药登记毒理学试验方法、新药毒理学研究指导原则、化妆品安全性评价程序和方法等列为评价致突变性的必做试验。,1、原理 致突变物使发光细菌暗变异菌株突变，恢复一定的发光能力。 菌株：蝠鱼发光杆菌的暗变异菌株SD-18和RC93、费氏弧菌的暗变异株Pf-13、明亮发光杆菌T3小种的暗变异株T9171。 2、方法 细菌复苏、增殖、分装测试管培养（20C、）、 24h后开始测发光强度，以后每隔3-4天测定一次。 发光强度为对照管发光强度的3倍或以上即为阳性。,（二）发光细菌试验,（一）SOS显色试验 SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生存率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（error-prone repair），使细胞有较高的突变率。 致突变物DNA损伤 细菌SOS修复测定SOS修复能力 （通过大肠杆菌PQ37菌株的显色反应）,二、DNA损伤修复试验,PQ37菌株的特点：操纵子融合方法构建的，将SOS反应网络中的sfiA基因与编码-半乳糖苷酶的基因lacZ融合在一起（报告基因）， -半乳糖苷酶通过Xgal培养基和 ONPG培养基来显色，分别产生蓝色和黄色。,定性试验： Xgal培养基平板，纸片点试,出现蓝色色素即为阳性。 定量试验：液体培养基（含待测样品）,37C,2h ,加入ONPG显色一定程度，终止反应，420nm处测吸光度。R大于2且具有剂量关系，则为阳性结果。 应用评价：敏感性与准确性与Ames试验相当，某些方面优于后者，可以相互补充。,（二）聚合酶缺陷型菌株试验 致癌物使DNA受损，聚合酶缺陷型菌株在DNA受损后无修复能力，不能生存，抑菌圈出现。E.coli P3478(polA-),对照为野生型菌株E.coli W3110(polA+)。 点试法、混菌法，分别出现抑菌圈和有空白的生长线（抑菌现象）。 对直接突变作用的烷化剂较为敏感，对需要代谢活化的化合物不敏感。,（三）重组缺陷型菌株试验 重组缺陷型菌株失去修复能力， 致癌性物质使DNA受损，重组缺陷型菌株不能生长，原理与聚合酶缺陷型菌株试验相似。 枯草芽孢杆菌H17(recA+）对照，全线生长 枯草芽孢杆菌M45(recA-）试验，抑菌现象,（四）溶源性细菌试验 原理：原噬菌体 诱变剂 烈性噬菌体（噬菌体诱导现象） 裂解非溶源性细菌（作为指示菌）固体培养基上出现噬菌斑 菌株：E.colik12