Cx32基因在肝癌细胞株中的表达与甲基化调节作用.doc

Cx32基因在肝癌细胞株中的表达与甲基化调节作用【摘要】 目的 了解Cx32基因在肝癌细胞株（HepG2）中的表达及甲基化调节作用。方法 采用不同药物浓度的甲基化转移酶抑制剂(5-杂氮脱氧胞苷5-Aza-CdR)分三组培养细胞株，免疫组化分析Cx32蛋白表达，甲基化特异性PCR检测Cx32基因的甲基化状态。结果肝癌细胞株Cx32蛋白表达减少，去甲基化后Cx32基因表达增加且定位异常，细胞生长减慢，三组细胞总阳性率分别为18.5、77、88，具有显著性差异(P0.01)。三组细胞Cx32基因甲基特异性PCR结果分别为甲基化、部分去甲基化及完全去甲基化。结论肝癌细胞株（HepG2株）中Cx32表达减少，受甲基化抑制，去甲基化可增加Cx32表达。 【关键词】 肝肿瘤 连接蛋白32 甲基化 连接蛋白32（connexin32，Cx32）是正常肝脏中主要表达的连接蛋白之一，对维持肝细胞的正常功能具有重要作用，Cx32表达异常与肝癌的发生发展有关，是肝癌抑癌基因1，其下调机制不是很清楚。国外研究提示肾癌中Cx32受到甲基化抑制2，本文进一步研究肝癌细胞中Cx32表达下调是否与基因甲基化有关，探索增加或恢复肝细胞癌中Cx32正常表达的可能机制。 1 材料与方法 1.1 材 料 HepG2肝癌细胞株（湘雅医学院中心试验室细胞库提供）；鼠抗Cx32及二抗试剂盒（Zymed公司）；QIAamp DNA抽提试剂盒(QIAGEN公司)；5-Aza-CdR、亚硫酸氢那钠、氢醌（Sigma公司）；DNA纯化试剂盒(Promega公司)。引物参照文献设计如下：甲基化引物：sense 5-GGGGCGGGTGCGGCGAT-3、antisense 5-CTCCGCGCCTGCGCCC-3；非甲基化引物：sense5-GGGGTGGGTGTGGTGAT-3、antisense 5-CTCCACACCTACACCCAA-3。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，OD值均为2，扩增片段均为245bp。 1.2 研究方法 细胞培养及处理：肝癌细胞株（HepG2）采用含双抗（青霉素、链霉素100U/L）及10胎牛血清的高糖型DMEM培养，按不同5-Aza-CdR浓度分三组（0mol/L组、1mol/L组、5mol/L组），分别在25cm2培养瓶和带玻片的6孔培养板中培养，每组培养瓶5瓶、培养板5板，重复3次。取对数期生长细胞，每瓶和每孔分别接种细胞2104、8103。先用不含药物的培养液培养24h待细胞贴壁后弃去培养液，换用含相应药物浓度的培养液继续培养72h，每天在显微镜下观察、计数细胞（计数按血细胞计数方法）一次，重复计数结果取均值列表并进行统计分析。 细胞免疫组化：按试剂盒说明采用ABC三步法。结果判断：参照Barnes等3方法进行半定量评分（分A、B项）：A项，按切片中细胞显色深浅计分：0分：细胞无显色，1分：显浅黄色，2分：显黄色，3分：显棕黄色；B项，按显色细胞的比例评分：1分：1%30，2分：31%75，3分：76%100。两项指标结合积分：阴性（-）积分为0分；阳性（+）积分14分；强阳性（+）积分56分。每组计数5个视野，每个视野计数200个细胞。 甲基化特异性PCR：参照说明提取、亚硫酸氢钠及氢醌等修饰、提纯DNA，PCR反应体系50l，反应条件：94变性2min；94变性30s、70退火1min、72延伸30s循环40次；72延伸5min。 1.3 结果判断 甲基化阳性为M阳性、U阴性；部分去甲基化为M阳性、U阳性，但OD值减弱；完全去甲基化为M阴性、U阳性。 1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包，分别采用多因素方差（MANOVA）分析、Kruskal-Wallis H检验和Nemenyi检验，P0.05有统计学意义。 2 结 果 2.1 细胞培养结果 显微镜下观察细胞培养，随着5-Aza-CdR的剂量递增，细胞数增殖减慢，细胞形态变得较规则，病理性分裂减少。各组细胞计数结果取均值列表（见表1）， MANOVA分析，具有显著性差异（F=56.13，P0.01）。 2.2 细胞免疫组化结果 结果表明：Kruskal-Wallis H检验 H204.32，P0.01；采用Nemenyi法检验两两比较，21,2258.33，21,3391.83，22,313.85，P值均0.01。表明经甲基化酶抑制剂处理后Cx32表达定位异常（主要表达于胞浆）、表达增加，各组间差异均有显著性，即2组高于1组，3组高于2组。见表2，图15。 2.3 甲基化检测结果 甲基化检测结果见图6。1组为甲基化（M）阳性而去甲基化（U）阴性；2组为部分甲基化阳性即甲基化（M）阳性，去甲基化（U）也为阳性但OD值减弱；3组则完全逆转，甲基化（M）阴性而去甲基化（U）阳性。 3 讨 论 Cx作为细胞间隙连接通讯（gap junctional intercellular communication，GJIC）的结构基础在多细胞生物中表达。对细胞生长、增殖、分化、维持内环境稳定等起着重要的调节作用4。近年大量研究显示Cx在多种肿瘤中表达减少，属于抑癌基因，与多种肿瘤包括肝细胞癌的发生、发展有关，但是Cx在肿瘤表达下降的机制不很清楚，国内外相关研究也不是很多。DNA甲基化通常发生在基因启动子区域CpG岛中的胞嘧啶部位形成CmpG，使基因变构，直接或间接抑制基因转录，是一种很常见的抑癌基因沉默机制，已经在多种抑癌基因中得到证实。有关Cx抑癌基因的甲基化调节目前研究不多，Cx32基因启动子富含CpG岛，已经在肾癌中证实其表达下降的原因与甲基化有关。肝细胞癌中Cx32表达减少，可能也与其基因甲基化有关，目前国内外尚未见确切报道。本文利用不同浓度的甲基化转移酶抑制剂（5-Aza-CdR）干预HepG2肝癌细胞株，结果显示未干预组，Cx32基因蛋白质表达减少，甲基化阳性，细胞生长快，病理性核分裂较多；药物干预后Cx32基因部分或完全去甲基化，基因蛋白质表达增加、定位异常，与干预剂量呈正相关，细胞生长减慢，恶性程度下降。统计学分析差异具有显著性。这一结果与国内外研究一致。表明肝癌细胞株中Cx32的表达受基因甲基化的抑制，去甲基化可以增加表达，定位异常提示还受到其他因素的调节，如翻译后磷酸化修饰、Ca2+、cAMP浓度等5，6都可以影响Cx32的装配和转运而导致定位异常。随着Cx32表达增加，细胞生长减慢，恶性程度下降，再次证实Cx32具有抑制肿瘤生长的作用，当然也可能5-Aza-CdR的强有效去甲基化作用，使其他抑癌基因表达增加，协同抑制肿瘤生长的结果。通过本研究，对于Cx32的调节机制、抑癌作用有了更加深入的认识，对于肝癌及其他受到Cx32抑制的恶性肿瘤的诊治提供一定的实验依据。【参考文献】 1 Fujimoto E, Sato H, Shirai S, et al. Connexin 32 as a tumor suppressor gene in a metastatic renal cell carcinoma cell lineJ. Oncogene, 2005, 24(22):3684-3690.2 Ayako H, Yyano T, Nishikawa K, et al. Down-regulation of connexin32 gene expression through DNA methylation in a human renal cell carcinoma cellJ. Am J Nephrol, 2003, 23(3):172-177.3 Barnes DM, Dublin EA, Fisher CJ, et al. Immunohistochemical detection of p53 protein in mammary carcinoma: an important new independent indicator of prognosisJ. Hum Pathol, 1993, 24（5）:469-476.4 Tano T, Fujinoto E, Habiwara H, et al. Connexin 32 as an anti-invasive and anti-metastatic gene in renal cell carcinomaJ. Biol Pharm Bull, 2006, 29(10):1991-1994.5 Matesic DF, Rupp HL, Bonney WJ, et al. Changes in gap-junction permeability, phosphorylation and number mediated by phorbol ester and non-phorbol-ester tumor promoters in rat liver epithelial cellsJ. Mol Carcinogenesis, 1994, 10(4):226.6 Jongen WMF, Fitzgeral