DcR3在结肠癌患者外周血及癌组织中表达水平的检测.doc

DcR3在结肠癌患者外周血及癌组织中表达水平的检测 作者：胜利, 安利峰, 史霖, 范桂香, 袁育康【关键词】 DcR3; 结肠癌; 表达 诱骗受体3(decoy receptor 3, DcR3)是新近发现的一种可溶性的肿瘤坏死因子受体（tumour necrosis factor receptor, TNFR）家族成员1。研究表明它在某些肿瘤、 自身免疫病等疾病中高度表达, 其蛋白的表达和基因的扩增与人类多种恶性肿瘤的发生、 发展以及肿瘤的免疫逃逸密切相关2。故我们研究DcR3在结肠癌患者外周血及癌组织中的表达, 阐明其与结肠癌的相关性。 1 材料和方法 1.1 标本来源 2004-05/2005-12在西安交通大学医学院第一附属医院就诊, 经病理学确诊的结肠癌患者44例, 男25例, 女19例, 年龄2778岁, 平均52岁。经病理学确诊的其他消化道肿瘤患者20例, 男12例, 女8例, 年龄3472岁, 平均48岁。健康对照组30例, 男18例, 女12例, 年龄2865岁, 平均46岁。癌组织石蜡包埋组织26例。其中结肠癌患者17例, 其他消化道肿瘤患者9例。 1.2 主要仪器和试剂 TMSF倒置显微镜为日本尼康产品; 7700型荧光定量PCR仪为美国PE公司产品; TannonGIS型全自动凝胶成像分析系统购自上海Tannon公司; 细胞总RNA TRIzol提取液及DNTPs购自Promega公司; cDNA第一链合成试剂盒为美国Fermentas产品; Taq DNA聚合酶购自晶美生物公司; 引物由大连宝生物生物工程公司合成; DcR3单克隆抗体（mAb）由汤南博士惠赠; S100蛋白和SP试剂盒均购自北京鼎国生物公司。 1.3 方法 1.3.1 外周血单核细胞分离 每个实验对象抽取5 mL静脉血, 肝素抗凝, 用常规密度梯度离心法分离外周血单个核细胞, 用预冷的生理盐水洗3遍后, 迅速放入-70冰箱冻存备用。 1.3.2 RTPCR 检测DcR3mRNA的表达水平 用细胞总RNA TRIzol提取液提取总RNA, PCR扩增, PCR产物经15 g/L的普通琼脂糖凝胶电泳后, 溴化乙啶染色, 通过TannonGIS影像分析仪进行DNA条带和强度分析, 把DcR3和actin的比值作为DcR3基因的相对表达水平进行比较。 1.3.3 免疫组化检测DcR3蛋白的表达水平 免疫组化染色SP法, 按说明书进行操作。 1.3.4 统计学分析 DcR3基因相对表达水平数据以xs表示, 采用组间配对t检验。 2 结果 2.1 DcR3mRNA水平的检测 结果显示, 结肠癌患者、 其他消化道肿瘤患者和健康人外周血单核细胞中均检测到DcR3基因的表达。PCR产物电泳后在144 bp大小位置均见有一清亮条带, 与预计的DcR3基因片段大小一致, 同时在660 bp大小位置也显示有清亮条带, 此为内参照基因actin片段产物（图1）。DNA条带和强度分析显示, 结肠癌患者外周血单核细胞DcR3基因呈过度表达, 其相对表达水平为0.4210.075, 而其他消化道肿瘤患者和健康人外周血单核细胞中DcR3基因有低水平的表达, 其相对表达水平分别为0.2480.076和0.2350.074（图2）。结肠癌患者与其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3基因表达水平相比有差异(P<0.05), 而其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3基因表达水平相比则无统计学意义(P>0.05)。 2.2 DcR3蛋白表达水平的检测 DcR3定位于细胞质和癌巢周围间质细胞, 以至少有20%的肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞, 400倍光镜下随机选取5个视野计数, 判断DcR3阳性表达率。结果显示, 17例结肠癌组织中有13例 (76.47%)阳性表达, 而9例其他消化道肿瘤组织中仅有1例(11.11%)阳性表达, 正常结肠组织均无表达（图3）。结肠癌患者与其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3蛋白表达水平相比有统计学意义(P<0.05), 而其他消化道肿瘤患者和健康人DcR3蛋白表达水平相比则无统计学意义(P>0.05)。 3 讨论 本研究对经病理学确诊的结肠癌患者44例、 其他消化道肿瘤患者20例、 健康对照组30例, 采用RTPCR法检测了外周血中的DcR3 mRNA表达水平; 对经病理学确诊的结肠癌患者17例、 其他消化道肿瘤患者9例和5例正常结肠组织做免疫组化, 检测了DcR3蛋白表达水平。发现结肠癌患者血中DcR3 mRNA及癌组织中DcR3蛋白表达明显高于正常人和其他消化道肿瘤患者, 说明结肠癌发生时DcR3 mRNA和蛋白表达异常升高, 可以推断DcR3异常表达与结肠癌有一定的关系。有研究1, 2表明许多人类恶性肿瘤显示DcR3无论在基因水平还是在蛋白水平均出现过度表达, 而且这种过度表达仅仅出现在肿瘤组织中, 临近的正常组织则几乎测不出DcR3的表达, DcR3表达状态与肿瘤分化程度、 淋巴结转移及TNM分期显著正相关。本研究结果与其研究结果相符。 目前, 尽管结肠癌病因及发病机制尚未完全明了, 但是认为其发病机制主要与免疫逃逸有关3。有研究表明其免疫逃逸主要是因为由Fas/FasL通路介导的细胞凋亡减少所致4。Fas抗原(APO1/CD95)与Fas配体(FasL)组成的Fas系统, 在将凋亡信号转导入细胞内发挥重要作用。大多数良性肿瘤Fas表达类似正常组织, 而恶性肿瘤的Fas表达明显下降或丢失, 推测恶性肿瘤的发生发展可能与Fas丢失, 逃避通过Fas/FasL系统的清除作用有关。对比正常结肠组织与结肠癌细胞Fas表达情况, 发现结肠癌细胞Fas表达明显下调或缺失。从正常结肠上皮到结肠良性新生物、 恶性肿瘤, Fas持续减少。丧失的程度与疾病程度有关, 腺瘤缺失10%, 而癌缺失88%, 转移大肠癌几乎完全丢失, 表明Fas的丧失加剧了大肠癌的进程。 DcR3通过竞争性结合FasL及竞争性抑制LIGHT, 阻断表达FasL及与LIGHT结合的HVEM的细胞死亡5, 并呈剂量依赖性。同时DcR3在肿瘤血清及组织中浓度的高低与其恶性度呈正相关6。DcR3几乎完全阻断了FasL与Fas的结合, 基本抑制了成熟T淋巴细胞的AICD（活化诱导的细胞死亡）作用。沈宏伟等7研究发现, 代表肿瘤进展的临床病理因素均与DcR3基因表达相关, 而代表肿瘤生物学行为的因素中仅有肿瘤的浸润和转移与之相关。 综上所述, 我们是否可以推断DcR3基因和蛋白表达异常升高可能是结肠癌免疫逃逸的重要原因。但是, 目前尚无资料证明DcR3过度表达必然引起结肠癌, 亦无证据表明结肠癌相关致病因子能影响DcR3的表达, 因而仍不能明确DcR3过度表达是否参与结肠癌的免疫逃逸, 或者仅仅是伴随的表现。我们仍需深入研究DcR3表达的影响因素, 来确定其与结肠癌免疫逃逸的关系。【参考文献】 1 Pitti RM, Marsters SA, Lawrence DA, et al. Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancerJ. Nature, 1998, 17396(6712): 699-703.2 Yu KY, Kwon B, Ni J, et al. A newly identified member of tumor necrosis factor receptor superfamily (TR6) suppresses LIGHTmediated apoptosisJ. J Biol Chem, 1999, 274(20): 13733-13736.3 Rayter Z, leicester RJ. Adjuvant chemotherapy for colorectal cannerJ. Ann RColl Surg, 1995, 77(4): 81-84. 4 Reyhar U, Strater J, Kittstein W, et al. Colon carcinoma cell use different Mechanisms to escape CD95mediated apoptosisJ. Cancer Res, 1998, 58（3）: 526-534.5 Bai C, Connolly B, Metzker ML, et al. Overexpression of M68/DcR3 in human gastrointestinal tract tumors independent of gene amplification and its location in a fourgene clusterJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(3): 1230-1235.6 Elnemr A, Ohta T, Yachie A, et al. Human pancreatic cancer cell