RECK在人喉鳞癌组织中的表达及临床意义.doc

RECK在人喉鳞癌组织中的表达及临床意义【摘要】 目的 通过检测80例人喉鳞癌组织中RECK的表达情况，讨探RECK在喉鳞癌发生发展中的作用。方法 用免疫组化法、蛋白印迹分析(Western blot)技术，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测在喉鳞癌组织标本中RECK的表达。结果 RECK蛋白在正常喉组织及喉鳞癌组织的大片癌巢中不表达，仅在角化珠中和粘膜固有层中的混合腺的腺细胞有表达。结论 本研究提示RECK基因在喉癌的发生发展中不起关键作用。 【关键词】 喉鳞癌;RECK基因 Abstract: Objective To discuss the potential role of RECK in Laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) by testing the expression of RECK in human LSCC, a total of 80 LSCC patients. Methods (1) RECK expression in surgically resected tissue samples of laryngeal carcinomas (n=80) were examined immunohistochemically;(2) The expressions of RECK was evaluated by Western blot and Reverse transcription polymerase chain reactions (RT-PCR). Results The positive RECK stained in the horny pearl and glandular tube cells, but not in the carcinomal cells. Conclusions RECK gene cant be considered as a key point in the pathogenesis of LSCC.Key words:Laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC); RECK gene喉癌是头颈部第二位原发于上皮的最常见的恶性肿瘤，发病率仅次于鼻咽癌。在过去40年里对喉癌的发病机理的研究已取得许多进步，但喉癌发生的确切机理、侵袭和转移的分子机制还不十分清楚。RECK ( reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs) 基因是近年来发现的新型基质金属蛋白酶抑制剂1，目前研究认为作为一种独立的膜锚合基质金属蛋白酶调节因子，RECK 基因在多种正常组织中均高表达，而在肿瘤组织中表达量明显下降甚至不表达，且 RECK 基因表达下降的幅度与肿瘤侵袭转移能力成明显正相关。因此，RECK 基因是目前研究较为广泛的一种抑癌基因。1 材料与方法1.1 临床资料喉癌组织80例,来源于2005年5月至2007年10月辽宁省肿瘤医院行喉癌手术的切除标本,患者年龄4281岁,平均60.5 岁,均保存有完整的临床和病理资料: I期24 例，II期12 例，III期22 例，IV期17 例。每1例石蜡切片皆包括癌组织和其癌旁的正常黏膜组织。1.2 免疫组化染色山羊抗人多克隆抗体RECK (150倍稀释)购自Santa Cruz Biotech，免疫组化SP 试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。所有组织均经甲醛固定，常规石蜡包埋，免疫组化SP 法染色参照试剂说明书进行，RECK采用高温高压法修复抗原。用已知的阳性切片作阳性对照，PBS 代替一抗作阴性对照。1.3 Western blot 法检测组织中RECK蛋白表达应用RIPA 裂解液裂解组织,应用分光光度计测定总蛋白浓度SDS-PAGE 凝胶电泳(90 V,2 h),电转仪电转,(300 mA,1.5 h,4 )。将硝酸纤维素膜与适当稀释的第一抗体(1200)室温下反应2 h, 再与用杂交液按比例(1：8 000)稀释的二抗杂交2 h, ECL反应显色。1.4 RT-PCR法检测组织中RECK基因的mRNA表达Trizol 一步法抽提组织中的总RNA,引物设计见参考文献2及国际互联网cDNA文库，由上海生物工程公司合成。RECK(477bp):5-CCTCAGTGAGCACAGTTCAGA-3(上游), 5-GCAGCACACACACTGCTGTA-3(下游);-actin(195bp)：5-CCATGGAGAAGGCTGGG-3(上游)，5-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3(下游)。扩增参数：94 预变性2分钟，94 变性 45秒，60 复性 45 s，72 延伸 45 s，扩增30 个循环，72 延伸加时 10 min，4 保存。2 %琼脂糖凝胶电泳后,采用生物图像分析仪检测RECK基因在不同组织中表达情况。1.5 结果判定免疫组化结果判定标准RECK以实质细胞胞膜或胞质出现明显的黄色或棕黄色颗粒判断为阳性着色。Western blot及RT-PCR结果见结果部分图示。2 实验结果2.1 免疫组化结果RECK阳性反应与分布特点 RECK蛋白在正常喉组织、喉鳞癌组织的大片癌巢中不表达(见图1)，仅表达于少数角化珠、粘膜固有层中的混合腺体的腺上皮细胞和鳞化的腺体组织(见图3、4、5)。以已知RECK阳性染色的肝组织作阳性对照(见图6)，以PBS代替一抗作阴性对照(见图2)。2.2 Western blot及RT-PCR结果分别采用与免疫组化同一病例的标本行Western blot及RT-PCR。结果见图7、8 所示，喉癌1(C1)无RECK蛋白表达和相应的mRNA扩增、肝组织(T) 有RECK蛋白表达和相应的mRNA扩增且呈强阳性、乳腺癌(C2)和正常乳腺组织(N2) 有RECK蛋白表达和相应的mRNA扩增，但C2的电泳条带密度值低于N2。结果与免疫组化一致。3 讨 论目前研究表明RECK基因是一种抑癌基因，是基质金属蛋白酶膜锚合调节因子，其编码971个氨基酸,定位于9p13-p12，整个基因的长度约87kb，其编码的蛋白质分子量大小为110kDa1-3。大多数基质金属蛋白酶家族成员以一种无活性的酶原形式被细胞合成并分泌至细胞外或结合于细胞表面膜表面，锚定的RECK蛋白可以抑制上述转化过程的每一步并且还可以直接抑制基质金属蛋白酶-2及基质金属蛋白酶-9对细胞外基质的裂解。通过免疫组化、Western blot、明胶酶谱法、RTPCR检测发现：RECK基因在大部分正常细胞株及正常组织中均表达，但在多种肿瘤组织及细胞株中不表达。Satoshi4等人发现在多种原发于狗的良、恶性肿瘤有不同程度的表达，其中上皮性肿瘤有鳞癌(例如皮肤鳞癌、口腔鳞癌、鼻咽鳞癌)、肛周腺瘤、肛周腺癌、移行细胞癌、肝癌存在RECK基因的表达，在肥大细胞瘤中无表达。仅在肝癌中RECK表达量与正常组织存在明显差异。实验表明，在人非小细胞肺癌5、乳腺癌6、结肠癌7、前列腺癌8等组织中RECK基因表达量较相应的癌旁正常组织明显下降。但RECK是否在人正常喉组织及喉鳞癌组织中表达及其在喉鳞癌发生发展中所起的作用目前尚未见到相关的报道。在本研究中按照不同解剖分区、病理分化程度、有无淋巴结转移将80 例喉癌手术标本分类进行研究。通过免疫组化染色发现RECK蛋白表达仅存在于粘膜固有层中的混合腺体的腺上皮细胞和少数高分化鳞癌的角化珠及其周围细胞中，而在中分化癌巢及大部分癌巢的非角化细胞中及正常喉组织中未发现RECK蛋白阳性表达。在不同解剖分区、不同病理分化程度及是否出现淋巴结转移的喉癌组织中RECK蛋白均呈阴性表达。这与Takenaka K51620、李晟磊9、姚金光10的研究结果不一致。Takenaka K等研究了171 例非小细胞肺癌，RECK蛋白表达阳性率为89.5%,其中有鳞癌63 例。本文与Takenaka K等的研究不一致的原因考虑为绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，故肺癌实为支气管癌。支气管粘膜表面为假复层纤毛柱状上皮，肺癌的发生是在致癌因子的作用下，经鳞状上皮化生、非典型增生、原位癌等阶段发展为浸润癌。喉的粘膜以复层扁平鳞状上皮为主，喉鳞癌的发生发展是从不典型增生开始，逐渐从原位癌变成浸润癌。这种组织来源上的不同可能导致了结果的不同。李晟磊等对62例食道癌及正常食道粘膜组织、31例癌旁组织进行研究发现食道鳞癌组织中RECK mRNA 和蛋白表达均降低, 其低表达可能与食道鳞癌发生有关。食道癌的癌变方式有两种：最常见的是过渡性病变即底层细胞(立方或柱状细胞)增生并向深部活跃生长，形成团块或细条索状向固有膜深部伸展为食道癌旁上皮而该部中表层上皮(复层扁平鳞状上皮)则无明显的不典型增生。另一种癌变是不典型增生始于底层细胞逐渐向中表层扩展，最终漫及全层而形成原位癌，然后发展为浸润癌。即食道癌的病变是由食道的底层细胞(立方或柱状细胞)并非食道粘膜最表层的复层鳞状上皮病变而来。另据研究认为。在胚胎发育中食管一度为单层柱状上皮，上皮向内生长形成粘液腺，以后单层柱状上皮转变为复层扁平上皮，但这些腺体及部分上皮残留下来成为食管贲门腺和胃粘膜岛，这种异位的胃上皮与食道癌的发生有重要关系。这也许就决定了虽然食道与喉的粘膜同为复层扁平鳞状上皮，但RECK蛋白在两种组织中的表达却明显不同。姚金光等对59 例舌癌手术标本进行研究，发现舌癌组织RECK蛋白的免疫组化染色强度偏低,其中(-)(+) 的例数为25 例,占42.37 %,RECK 蛋白表达水平在舌癌浸润程度深、颈部淋巴结转移的患者中表达水平明显降低。虽然舌与喉的粘膜同为复层扁平鳞状上皮，但正常舌粘膜为角化上皮舌癌组织中的角化成分很多而喉粘膜为未角化上皮仅在高、中分化喉癌组织中存在角化珠。在本研究中发现RECK蛋白在角化成分中表达，在非角化细胞中无表达。因此导致了RECK蛋白在不同器官的鳞癌组织中表达不同。细胞遗传学的改变构成喉鳞癌发生的基础。因为许多分子遗传学改变是由于染色体的改变而致,目前研究发现：喉鳞癌主要为+7p(7号染色体短臂拷贝数增益)，+9q(9号染色体长臂拷贝数增益)，+11q12-13(11号染色体长臂1区2带至1区3带拷贝数增益)，+14q(14号染色体长臂拷贝数增益)和+17q(17号染色体长臂拷贝数增益)，RECK基因定位于9p13-p12，它定位的染色体区并不是喉鳞癌的典型肿瘤相关基因组区域，我们考虑喉鳞癌组织中未有相应的RECK蛋白印迹和mRNA扩增的原因可能与此有关，因此RECK基因在喉鳞癌的发生、发展中并可能没有起到关键性的作用。(此文图1-8见第95页)【参考文献】 1 Takahashi C, Sheng Z, Horan TP, et al.Regulation of matrix metalloproteinase-9 and inhibition of tumor invasion by the membrane-anchored glycoprotein RECKJ.Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(22)：13221-13226.2 张勇, 郑启昌, 卢昕，等.肿瘤抑制基因RECK在胃癌中的表达及临床意义J.肿瘤防治杂志,2005, 12 (2) ：110113.3 Makoto N, J unseo O, Takahashi R, et al .RECK：A novel suppressor of malignancy linking oncogenic signaling to extracellullar matrix remodelingJ.Cancer Metastasis Rev, 2003, 22(6)：167-180.4 Takagi S, Kato Y, Asano K, et al.Matrix metalloproteinase inhibitor RECK expression in canine tumorsJ. 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