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TM4SF9在大肠侧向发育性肿瘤细胞株中的表达及意义 作者：耿焱，姜泊，赖卓胜，张宏权，马文敏，王新颖 【关键词】 ,大肠侧向发育型肿瘤 Expression and significance of TM4SF9 in laterally spreading colorectal tumor【Abstract】 AIM: To investigate different expressions of TM4SF9 in laterally spreading tumor (LST), Lovo and SW480 cell lines and to study the relationship between TM4SF9 mRNA expression and the adhesion ability of these cell lines. METHODS: Common different expression genes among those cell lines were detected by microarray technology and TM4SF9 was screened out for further research. Semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) technology was used to demonstrate the result and the adhesion ability was tested by adhesion experiment. RESULTS: Microarray showed that there was a common differential expression in TM4SF9 among LST, SW480 and Lovo cell lines and this result was determined by semiquantitative RTPCR. Adhesion experiment indicated that the cell line with the highest TM4SF9 expression showed the best adhesion ability. CONCLUSION: There exists a common different expression in TM4SF9 among LST, SW480 and Lovo cell lines. TM4SF9 is overexpressed in Lovo which has the strongest adhesion ability and may regulate specific biological functions of LST.【Keywords】 laterally spreading tumor; TM4SF9; protein array analysis; reverse transcriptase polymerase chain reaction【摘要】 目的： 研究四分子交联体5（TM4SF9）在大肠侧向发育性肿瘤（laterally spreading turmor, LST）、SW480和Lovo细胞中的差异表达，以及TM4SF9表达差异与三个细胞株黏附能力的关系. 方法： 用基因芯片技术研究3个细胞株的共同差异表达基因，从中筛选出TM4SF9作为研究对象，用半定量RTPCR技术验证基因芯片检查结果，用黏附实验研究3个细胞株黏附性的差异. 结果： 基因芯片检查发现TM4SF9在3个细胞株中都有表达，Lovo细胞株表达最强，LST表达最弱，半定量RTPCR检查与基因芯片检查结果相符，黏附实验显示TM4SF9表达水平最高的细胞黏附性最强. 结论： TM4SF9在LST，SW480，LOVO 3个细胞株中存在差异表达，黏附性较强的细胞株表达较高，其与LST特性的关系值得进一步研究.【关键词】 大肠侧向发育型肿瘤；四分子交联体5；蛋白质阵列分析；逆转录聚合酶链反应0引言平坦型大肠肿瘤包括表浅型和凹陷型，表浅型以大肠侧向发育性肿瘤（laterally spreading turmor, LST）为代表1. LST特点是极少向肠壁深层垂直侵犯，而主要沿黏膜表面呈侧向浅表扩散2. LST的癌变率可达8.4%52.0%，并可以在3年内发展成为进展期大肠癌2，3. 我国目前对LST病变的研究尚属空白. 研究LST侧向生长及高恶变倾向的分子生物学机制，有可能对早期大肠癌的发生发展过程提供有价值的资料及线索，并在分子水平上找到早期诊断的可靠依据. 我们通过基因芯片研究LST, Lovo, SW480 3个细胞株的差异表达基因，筛选出四分子交联体5或称跨膜4超家族成员9（transmenberance 4 superfanily 9, TM4SF9）作为研究对象，用半定量RTPCR验证，用黏附实验研究3个细胞株黏附性的差异与TM4SF9表达水平的关系，以探讨TM4SF9与LST侧向生长及高恶变倾向的分子生物学机制的关系.1材料和方法1.1材料大肠LST细胞株为南方医科大学消化病研究所建株并保存4. SW480和Lovo大肠癌细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所. 人类全基因表达谱分析芯片（HC10001）中科开瑞生物芯片公司；Trizol试剂Gibco公司；RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis KitFermentas公司；PreMix PCR试剂盒赛百盛公司；TM4SF9基因片段引物参照基因文库NM_005723序列设计，GAPDH参照文献4设计，博亚公司合成，序列: TM4SF9: sense (197) 5TTGTGGTGGGAGGAGTGAT3, antise (444) 5 CT GGGTGAAGTCTATGAGGTT3; GAPDH: sense 5 CCATGGAGAAGGCTGGGG3, antise 5 CAAAGTTGTCATGGATGACC3. 3K30高速低温离心机Sigma公司；UNO II PCR扩增仪Biometra公司；UVI凝胶成像系统Collagen ISigma公司； 48孔培养板Corning公司.1.2方法1.2.1细胞培养3个细胞株均在37 50 mL/L CO2条件下，培养于含10 mL/L小牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI1640中,每周传代2次.1.2.2基因芯片5,6用Trizol提取200 g总RNA，按照Oligotex mRNA spincolumn protocal分离纯化mRNA. 用通用测序PCR引物扩增中科开瑞科技股份有限公司所提供的18 816个基因克隆作为模板. 表达谱芯片由2个半张大小为8 cm12 cm尼龙膜组成. 每半张芯片上排列384个小矩阵（1624），每个探针在矩阵中排布2点，平均点样量20 ng. 正方形方阵右上角设空白点作阴性对照，每4个方阵设1个阳性对照，在选定方阵的右下方（方阵外）. 整张芯片共有8个看家基因，为常见的核蛋白体蛋白、核糖体蛋白等. BG600点样仪点样，紫外交联，晾干备用. 在逆转录体系中加入mRNA 0.75 g，MMLV酶2 L，a33PdATP 10 L标记，按Promega公司提供说明操作. 预杂交结束后，弃去预杂交液，加入杂交液6 mL，变性过的鱼精DNA （100 mg/L）60 L和40 L标记好的探针. 置入杂交炉中68杂交20 h. 杂交后严格洗膜，测量膜正面Counts，磷屏压片72 h. FLA3000扫描仪扫描芯片信号图像，ArrayGauge1.0软件分析. 判定基因差异表达的标准： 一对样本的信号平均值2或个2而另个10；信号值变异系数0.33 ；信号平均值有2倍以上表达差异的基因.1.2.3半定量RTPCR取5 g总RNA，按RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit操作说明合成cDNA.第一链. 取cDNA和两对引物（20 moL/L）各1 L加入50 L标准PCR反应体系中（成份见说明书），94预变性2.5 min，然后进入以下32个循环： 94变性45 s，68退火1 min，72延伸1 min. 循环完毕，72延伸5 min. 实验结果重复3次，取5 L扩增产物在20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，UVI凝胶成像系统成像，gelpro analyser3.2软件做半定量分析. PCR扩增产物测序交博亚公司完成.1.2.4黏附实验LST, SW480, Lovo细胞株各组，每组设3个孔. 取细胞对数生长期，用无血清RPMI1640培养过夜. 10 g/L collageon 溶液（1PBS配制）每孔150 L，置37铺板1 h. 10 g/L BSA（1PBS配制）煮沸13 min变性后，每孔加200 L封闭1 h，封闭结束后用1PBS冲洗2次. 用2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞，1PBS洗涤细胞，800 r/min, 5 min离心沉淀细胞，弃上清，将细胞重悬于含氯化钙1 mmol/L，氯化镁1 mmol/L，氯化锰0.21 mmol/L及5 g/L BSA的RPMI1640中，调整细胞密度为1108/L. 按200 L/孔加入细胞悬液，37温育1 h. 取出48孔板，1PBS冲洗5次，33 g/L甲醛固定，相差显微镜下每空随机取6个高倍镜视野计数.统计学处理：数据以xs表示，应用SPSS软件对数据进行转换，在方差齐性的基础上应用方差分析，组间两两比较用LSD法，P<0.05表示有统计学意义.2结果 2.1基因芯片性能尼龙膜上LST, SW480, Lovo重复点的R2分别为0.9716(y=0.9773x), 0.9858(y=0.9794x)和0.9823(y=0.9959x)，提示芯片重复性好. LST, SW480, Lovo细胞株之间符合筛选标准的差异表达基因97个，其中共上调58个，共下调39个. 差异表达的基因按功能分类显示以信号传导传递、代谢、发育和分化类为最多. 选择TM4SF9作为研究对象. TM4SF9属于信号传导传递、发育和分化类基因，在LST，SW480和Lovo中的信号值分别为0.6712, 4.9445和15.7723, Lovo较LST上调表达20倍，较SW480上调表达10倍.2.2基因分析琼脂糖凝胶电泳显示TM4SF9和GAPDH扩增片断大小分别在247 bp和195 bp （Fig 1），测序结果证实为TM4SF9基因片断. 实验重复3次，LST, SW480, Lovo相对表达量（TM4SF9/GAPDH）分别为0.340.08, 0.580.07, 0.780.11, F值为19.235(P<0.01)，其中LST低于SW480, Lovo （P<0.05），SW480低于Lovo （P<0.05）.2.3LST黏附细胞LST黏附细胞数明显少于Lovo （P<0.001）和SW480 （P<0.001）, Lovo的黏附细胞数多于SW480 （P<0.01）. TM4SF9表达最强的Lovo细胞株黏附性最强(Tab 1).表1LST, SW480, LOVO黏附细胞数（略）3讨论四分子交联体（tetraspanin）超家族，又称跨膜4超家族（transmenberance 4 superfanily, TM4SF），是一组以四次跨膜及两个大小不等的细胞外环状结构为主要特征的膜表面蛋白7. TM4SF成员可通过彼此间以及其他类型膜表面蛋白的联系，形成四分子交联体网（tetraspanin web），调节细胞的运动性，激发同类型的细胞的聚集，多种类型细胞的融合，以及细胞的信号传导，对恶性肿瘤细胞的转移能力有重要影响8. 目前对TM4SF9的研究主要集中在神经系统，它可以影响小鼠的神经细胞及神经胶质细胞的黏附、运动和增殖9,10，鲜有其与大肠癌关系的报道. 我们在研究发现，在LST, SW480, Lovo细胞株中存在着TM4SF9差异表达，黏附能力最强的Lovo细胞株表达最强，提示TM4SF9可能与大肠癌细胞的粘附能力有关. 基因芯片显示差异表达的基因以信号传导传递、代谢、发育和分化类为最多，而TM4SF9属于信号传导传递、发育和分化类基因，提示TM4SF9可能与LST的特殊生物学行为有关. 我们将对其做进一步的研究，一方面为解释LST侧向生长及高恶变倾向的分子生物学机制奠定基础，一方面加深对TM4SF9功能的了解，以期发现新的肿瘤相关基因.【参考文献】1姜泊，刘思德. 重视平坦型大肠肿瘤的临床诊治 J. 解放军医学杂志, 2004; 29(11): 925-927.Jiang B, Liu SD. Pay emphasis to the dianosis and treatment of flat tumors of colon J. Med J Chin PLA, 2004; 29(11): 925-927.2Nakagoe T, Ishikawa H, Sawai T, et al. Gasless, video endoscopic transanal excision for carcinoid and laterally spreading tumors of the rectum J. Surg Endosc, 2003; 17 (4):1298-1304.3Tamura S, Nakajo K, Yokoyama Y, et al. Evaluation of endoscopic mucosal resection for laterally spreading rectal tumors J. Endoscopy, 2004; 36 (1):306-312.4赖卓胜，韩宇晶，刘思德，等. 大肠侧向发育型肿瘤细胞株的建立及其鉴定J. 解放军医学杂志, 2004; 29(11): 934-937.Lai ZS, Han YJ, Liu SD, et al. Establishment of a novel epithelial cell line from laterally spreading tumor of colon J. Med J Chin PLA, 2004; 29(11): 934-937.5范德刚，范清宇，张惠中，等. 利用基因芯片技术筛选不同转移能力骨肉瘤细胞差异表达基因J. 第四军医大学学报, 2003; 24(9): 816-819.Fan DG, Fan QY, Zhang HZ, et al. Study on metastasis associated gene in osteosarcoma by cDNA microarray J. J Fourth Mil Med Univ, 2003; 24(9): 816-819.6杨磊，顾永清，潘泽民，等. 长期砷诱导L02细胞的表达谱基因芯片实验J. 第四军医大学学报, 2004;25(13): 1205-1207.Ya