严重烧伤早期大鼠肺泡巨噬细胞CD14的表达及调控.doc

严重烧伤早期大鼠肺泡巨噬细胞CD14的表达及调控 作者：李友良，叶祥柏，王光毅，郇京宁，陈玉林，夏照帆 【摘要】 目的 探讨严重烧伤对大鼠肺泡巨噬细胞（AM）CD14膜蛋白（CD14）和 mRNA基因表达变化的影响，以及抗CD14抗体对AM产生肿瘤坏死因子（TNF-）和白介素6（IL-6）的调控作用。方法 20%度烧伤大鼠检测早期外周血内毒素（LPS）浓度，体外分离培养AM，RT-PCR方法观察膜表面CD14 mRNA表达、免疫组化方法观察蛋白含量及ELISA方法观察分泌TNF-和IL-6的变化。烧伤血清刺激体外培养的正常大鼠AM，观察培养上清中TNF-和IL-6浓度变化及CD14抗体的抑制作用。结果 烧伤后外周血LPS各时相点LPS浓度均明显高于对照组，与此相对应，烧伤组大鼠AM各时相点CD14mRNA表达、蛋白含量均明显增高，AM 培养上清中TNF-和IL-6浓度亦显著增高（P0.01）。以烧伤血清与AM培养1h后，烧伤组培养上清中TNF-和IL-6浓度增加值明显高于对照组（P0.01），而在CD14抗体存在时，TNF-和IL-6浓度增加值明显小于烧伤组（P0.01）。结论 严重烧伤后外周血LPS浓度增加，AM膜表面CD14受体亦显著增加，使LPS对免疫系统的激活作用显著增大，AM分泌TNF-和IL-6明显增加，提示严重烧伤后可以通过调节CD14的作用而减少炎性介质的合成和分泌。 【关键词】 烧伤；肺泡巨噬细胞；CD14；TNF-；IL-6 【Abstract】 Objective To observe the role of pulmonary alveolar macrophage （AM） CD14 membraneprotein on the production of TNF- and IL-6 after severely burned rats in early stage.Methods SD rats were burned with 20%TBSA injury and the dynamic changes of plasma level of LPS was observed . After AMs of burned rats were isolated and cultured, level of CD14 mRNA expression and protein of AMs produced by AMs were detected with RT-PCR, immunohistochemical and ELISA methods respectively. In vitro, level of TNF- and IL-6 in the supernatant of normal rat AMs cultured with postburn serum with or without CD14 antibody were also detected.Results Level of plasma LPS increased significantly after severe burn injury. Correspondingly, the expression of CD14 mRNA and protein of AMs and level of TNF- and IL-6 in the supernatant of AMs also increased. When AMs were cultured with postburn serum, the level of TNF- and IL-6 in the supernatant increased significantly, which could be reversed at the present of CD14 antibody.Conclusion After severe burn injury, the role of LPS stimulation to immune system augments because of the increase of plasma LPS level and AMs CD14 receptor numbers, resulting in the increase of TNF- and IL-6 secretion. This indicates that the production of proinflammatory cytokines may be inhibited via modulating CD14 signal transduction. 【Key words】 burn; pulmonary alveolar macrophage; CD14; TNF-; IL-6 严重烧伤后大量肿瘤坏死因子（TNF-）和白介素6（IL-6）等前炎性细胞因子释放，导致全身炎症反应综合征（SIRS）的发生，单核-巨噬细胞在此过程中起关键作用，不仅是大量细胞因子的来源，也可能是后续炎症反应放大的启动因素，但其中的机制尚有较多不明之处。本实验通过观察内毒素（LPS）受体CD14在烧伤大鼠肺泡巨噬细胞（AM）产生TNF-和IL-6中的作用，及CD14抗体的阻断作用，探讨LPS信号传导通路对SIRS产生的影响，以及烧伤后抑制细胞因子过量分泌的可能途径。1 资料与方法 1.1 烧伤模型及烧伤血清制备 成年SD大鼠84只，体重150200g（第二军医大学实验动物中心提供），随机分为烧伤组和假烫组（对照组），再于各时相点分为7组，每组大鼠6只。气管穿刺注入PHA 0.4ml（100mg/ml），3天后进行实验。烧伤组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉，背部去毛，恒温水烫仪（第二军医大学烧伤科实验室研制）100烫10s，制成20%度烧伤模型。假烫组大鼠以37水模拟烫伤过程。分别于伤后1、2、4、6、8、10、12h处死动物，分离AM（见实验步骤1.3）和外周血血清，每只动物取血清0.5ml，进行LPS检测，其他血清置于 70冰箱备用。 1.2 LPS检测 取上述分离血清，依合成基质偶氮显色法试剂盒（上海医化所）主要步骤进行，反应终产物在波长545nm处比色测吸光度，依所测吸光度（A）值在标准曲线上换算成内毒素含量，每次检测标本分别绘制标准曲线。 1.3 AM的提取培养 大鼠处死后立即开胸，用PBS缓冲液行全肺在体支气管肺泡灌洗（BAL），灌洗液以250g 4离心10min，弃上清，加含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，调整细胞浓度为106/ml，接种于24孔板，每孔2ml，37 5%CO2温箱孵育1h，PBS洗去未贴壁细胞，贴壁细胞主要为AM，取部分细胞样品做细胞过氧化物酶纯度和台盼蓝拒染活力鉴定，纯度和活力均大于95。将上述部分细胞用于mRNA含量测定，部分进行CD14蛋白含量和分泌TNF-和IL-6含量测定。 1.4 AM CD14蛋白含量和分泌TNF-、IL-6浓度测定 细胞培养1h，提取培养上清，然后将细胞用丙酮固定10min后，60烘箱烘干后，置于-70冰箱保存待测定。将培养上清采用ELISA方法进行TNF-和IL-6浓度测定（ELISA试剂盒由R & D systems,Inc提供）；用ABC免疫组化法（试剂盒由上海华美生物技术公司提供）测定细胞膜表面CD14含量变化，检测阳性强度均值，阳性细胞呈棕黄色。 1.5 CD14 mRNA表达含量的测定 总RNA的提取采用TRIzol Reagent总RNA抽提试剂盒，操作步骤按试剂盒附带的操作指南进行。每标本取2l总RNA，根据Access RT-PCR试剂盒（promega 公司提供）实验步骤进行RT-PCR反应。取固定量的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶扫描成像分析仪处理系统进行光密度扫描，求出电泳条带的平均光密度与面积，用平均光密度与面积的乘积代表PCR扩增产物的相对含量，测定并比较严重烧伤后大鼠AM 各时相点CD14mRNA表达的变化。 本实验所用大鼠CD14引物和-actin按以下序列合成： 大鼠CD14引物 F 5- TGA GTA TTG CCC AAG CAC ACT - 3 R 5- GTA ACT GAG ATC CAG CAC GCT - 3 -actin F 5- TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG - 3 R 5- GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG - 3 产物各为373bp和764bp。 1.6 烫伤血清及CD14抗体对培养上清中TNF-和IL-6浓度的影响 正常成年SD大鼠，体重150200g，气管穿刺注入PHA 0.4ml （100mg/ml），3天后麻醉处死，按前述方法提取并培养AM，取18孔细胞，将收集的AM分为四组，A组加30烧伤血清，B组加30烧伤血清和抗体，C组加LPS，D组加LPS和抗体，抗体组烫伤血清中含有CD14 多科隆抗体（SC-6999,Santa Cruz Biotechnology, Inc提供）。每组按刺激后1，2，3，4，6，8，12h分7个时相点，每时相点检测5份细胞标本。假烫组加假烫血清，其余处理相同。细胞培养24h后，更换培养液。于培养1h后取上清，ELISA方法测定TNF-和IL-6浓度，上清中细胞因子浓度均为减去了培养0时相点的细胞因子浓度，即为各时相点细胞因子浓度的增加值。 1.7 统计学处理 数据用（xs）表示，采用t检验，定P0.05为差异有显著性。2 结果 2.1 烧伤后外周血LPS浓度变化 烧伤后血清中LPS浓度立即开始缓慢上升，至8h达高峰后开始下降，各时相点LPS浓度均明显高于对照组（见表1）。表1 烧伤后外周血LPS浓度变化（略） 注：与对照组比较，*P0.01 2.2 与假烫组比较 烧伤血清和LPS刺激后，A、C两组AM 膜CD14蛋白表达水平在各时相点均明显增加，阳性强度均值分别为（9.911.30）和（8.231.52），阳性面积占阴阳面积比值平均分别为（45.505.20）%和（45.154.20）%，阳性细胞比例分别为（48.575.35）%和（46.445.12）%。抗CD14抗体作用后，以上指标均显著下降，阳性强度均值分别为（3.330.43）和（3.030.43），阳性面积占阴阳面积比均值分别为（18.682.13）%和（21.872.62）%，阳性细胞比例分别为（22.002.34）%和（21.962.19）%，A组与B组、C组与D组相比较差异有显著性（P0.01）。 2.3 与假烫组比较 烧伤血清和LPS刺激后肺泡巨噬细胞CD14mRNA的表达在各时相点均明显增加（P0 01），阳性强度平均分别为（1.900.31）和（1.240.17），2h达峰值后缓慢下降，但12h内仍持续在较高水平。抗CD14抗体作用后，A组和C组CD14mRNA表达在各时相点均明显降低，阳性强度平均分别为（0.250.02）和（0.270.04）。烧伤血清组和LPS组相比差异无显著性。见表2,图14。表2 大鼠AM CD14 mRNA相对含量变化（略）注：与相应非抗体组比较，*P0.01 图1 体外培养AM烧伤血清组各时相点 PCR扩增产物电泳图，自左至右依次为Mark、1、2、3、4、6、8、12hCD14mRNA表达图2 体外培养AM烧伤血清 抗体拮抗组各时相点 PCR扩增产物电泳图自左至右依次为Mark、1、2、3、4、6、8、12hCD14mRNA表达 图3 体外培养LPS组大鼠AM各时相点 PCR扩增产物电泳图，自左至右依次为Mark、1、2、3、4、6、8、12hCD14mRNA表达 图4 体外培养AMLPS+抗体拮抗组各时相点 PCR扩增产物电泳图，自左至右依次为Mark、1、2、3、4、6、8、12hCD14mRNA表达 2.4 烧伤血清及CD14抗体对AM培养上清中TNF-和IL-6浓度的影响 培养1h后，对照组大鼠AM培养上清中TNF-浓度增加值为0.570.11，烧伤组TNF-浓度增加值明显增高（5.890.91）（P0.01），而抗体组TNF-浓度增加值（0.980.71）明显小于烧伤组（P0.01）。IL-6浓度变化亦有相同规律。见表3，表4。表3 大鼠AM刺激后分泌TNF-的变化（略）注：与相应非抗体组比较，*P0.01表4 大鼠AM刺激后分泌IL-6的变化（略）注：与相应非抗体组比较，*P0.01 3 讨论 严重烧伤后，免疫系统被激活，大量炎症介质释放，导致SIRS的发生，单核巨噬细胞在其中起关键作用1。肺组织是烧伤后全身炎症反应较易波及的一个靶器官，其局部的过度炎症反应即急性呼吸窘迫综合征（ARDS），而肺组织中的巨噬细胞-肺泡巨噬细胞（AM）被认为是诱发肺组织局部ARDS乃至全身炎症反应的重要效应细胞，在肺内，TNF-主要来源于AMs2。LPS已经被认为是SIRS发生的始动因素，既往的一些研究发现，烧伤后机体LPS显著升高，本研究的结果亦证实了这一点。巨噬细胞膜表面的CD14是LPS的受体3，在单核细胞激活及炎症反应过程中起关键性的作用4，5。然而烧伤后LPS如何诱发机体产生过度免疫反应，其机制尚不完全清楚。 本研究利用大鼠烧伤模型，观察烧伤后LPS刺激AM释放TNF-的细胞信号传导机制。研究发现，与烧伤后LPS相对应，烧伤后大鼠AM CD 14mRNA和蛋白表达量均显著升高，而AM细胞分泌TNF-亦显著升高。据此推测，烧伤后血清内LPS浓度显著升高，以及AM细胞膜表面其受体CD14转录和翻译过程增强导致蛋白含量、受体数量增加，使得LPS对机体免疫系统的激活作用被绝对或相对放大，致使炎性介质大量释放，从而引起SIRS的发生。为佐证这一观点，本研究利用烧伤血清刺激AM，以模拟烧伤后AM的液体环境，结果发现烧伤血清能刺激体外培养的AM释放TNF-，该效应可以被CD14抗体所阻断，由此进一步证实了上述推测。这也提示，通过对CD14的调控，有可能控制严重烧伤后细胞因子的过量合成和分泌，从而降低肺部ARDS及SIRS的发生率。目前已有关于通过调控烧伤后炎性细胞因子的释放以抑制过度炎症反应的研究报道6，在临床对阻断细胞因子过量分泌仍缺乏有效方法的情况下，通过调控LPS的受体CD14的表达，以达到抑制细胞因子的过度合成，值得进一步探索。【参考文献】 1 王光毅，田建广，唐洪泰，等. 大鼠烧伤后库普弗细胞在促炎性细胞因子产生中的作