人高迁移率族B1蛋白原核表达、纯化及抗体制备和初步应用.doc

人高迁移率族B1蛋白原核表达、 纯化及抗体制备和初步应用 作者：田爽, 刘民, 李欣, 浦永, 吴海东, 汤华【摘要】 目的: 原核表达并纯化人高迁移率族B1蛋白(HMGB1)免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法: 构建原核表达质粒pRsetA2HMGB1, 转化大肠杆菌BL21(DE3), HMGB1蛋白经异丙基D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni2+NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价, Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果: 成功构建原核表达质粒, 表达并纯化HMGB1蛋白。ELISA检测抗体效价为116 000以上, Western blot和免疫荧光染色确定抗体具有高度特异性。结论: HMGB1蛋白和抗体的成功制备, 为下一步研究将HMGB1作为肿瘤等疾病治疗的新靶点奠定基础。 【关键词】 HMGB1; 原核表达; 抗体; 癌症 高迁移率族蛋白(HMG蛋白)因其相对分子质量小(Mr<30 000), 在聚丙烯酰胺凝胶电泳中快速迁移而被命名。人高迁移率族B1蛋白(high mobility group box 1, HMGB1)基因位于染色体l3q12, 它包括3个不同的功能区, N末端(A区和B区)富含带正电荷的赖氨酸, 而C末端(C区)富含带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸1。HMGB1蛋白在胞内外都有分布, 根据其分布不同而发挥不同的生物学效应。细胞核HMGB1参与构建核小体, 维持其稳定性, 同时在DNA重组、 复制、 修复和基因转录中起重要的辅助作用。细胞外HMGB1具有细胞因子特性, 它与细胞分化、 迁移、 增殖、 凋亡以及炎症反应的诱导等密切相关2, 而且在人类病理状态下如Alzheimers病、 败血症、 局部缺血再灌注损伤、 关节炎和癌症中, 都伴随着HMGB1蛋白的失调。尤其是在癌症包括乳腺癌、 结肠癌、 前列腺癌、 肺癌等中, HMGB1蛋白过表达与肿瘤的增殖和转移有关3。本研究中原核表达HMGB1蛋白、 纯化并制备其抗体, 为深入研究将HMGB1作为肿瘤等相关疾病治疗的新靶点起到了基础性作用。 1 材料和方法 1.1 材料 人淋巴细胞RNA逆转录产物, 原核表达载体pRsetA2(由本实验室在pRsetA基础上改建而成, 将EcoR I和Xho I位点调换), 大肠杆菌XL1Blue、 BL21(DE3), 肿瘤细胞系均由本实验室保存。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成; Taq DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶、 标准蛋白marker购自Ferments公司; 各种限制性内切酶购自TaKaRa公司; DNA marker、 日本大耳白兔、 抗GADPH抗体、 辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG购自赛尔生物科技有限公司; Ni2+NTA Superflow层析纯化树脂购自Qiagen; 异硫氰酸(FITC)标记的驴抗兔IgG购自Jackson Immunoresearch Laboratories。其他所用化学试剂均为分析纯以上产品。 1.2 方法 1.2.1 引物设计及目的片段的扩增 根据NCBI基因库中HMGB1编码区序列以及原核表达载体pRsetA2上的多克隆位点, 通过Primer Premier5.0软件设计上下游特异性引物如下: 5GACGAATTCGCCACCATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3(划线处为EcoR I酶切位点) 5GCTCACCTCGAGGCTTCATCATCATCATCTTCTTCTTCATC3(划线处为Xho I酶切位点)。以人淋巴细胞RNA逆转录产物为模板进行PCR, 扩增条件为: 94预变性4 min, 然后94变性1 min、 58退火1 min、 72延伸1 min, 共31个循环, 最后72延伸10 min。PCR产物经琼脂糖(10 g/L)凝胶电泳后, 由凝胶成像系统拍照并鉴定。 1.2.2 原核表达质粒的构建 PCR回收产物和pRsetA2空载体以EcoR I和Xho I双酶切, 37水浴过夜后, 进行琼脂糖(10 g/L)凝胶电泳并回收, 然后在T4 DNA连接酶作用下室温连接4 h, 转化E.coli XL1Blue, 通过氨苄青霉素(Amp+)抗性筛选得到重组子。挑取阳性克隆小提质粒DNA并双酶切鉴定。 1.2.3 pRsetA26hisHMGB1融合蛋白的诱导表达 鉴定正确的质粒转化E.coli BL21(DE3), 涂布于Amp+抗性的LB平板37过夜培养。然后挑取单克隆于2 mL LB中, 37 230 r/min振荡培养过夜。次日按120比例接种培养物到10 mL新鲜的LB中, 37 230 r/min振荡培养约2 h, 直到A600=0.5-0.7。取1 mL作为诱导前对照, 其余的加入IPTG至终浓度为1 mmol/L, 30继续振荡培养4 h。然后5 000 g离心5 min, 去上清收集菌体, 加入Buffer B(100 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L TrisCl, 8 mol/L urea, pH8.0)重悬菌体后超声裂解, 10 000 g离心10 min留取上清。取部分上清加入上样缓冲液(含有100 mL/L 巯基乙醇)水浴煮沸5 min, 冰置待上样, 进行SDSPAGE电泳, 考马斯亮蓝染色分析。 1.2.4 融合蛋白的纯化 将表达融合蛋白的菌液转接到300 mL LB中扩大培养, 并按上述条件诱导表达和裂解菌体, 然后离心将上清液加到Ni2+NTA树脂中, 4旋转混匀30 min, 加入Buffer C(100 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L TrisCl, 8 mol/L urea, pH6.3)洗涤柱床去除杂蛋白, 再加入Buffer D(100 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L TrisCl, 8 mol/L urea, pH4.5)洗脱目的蛋白, 最后洗脱液经磷酸盐缓冲液(PBS)透析后-20保存。其中每一步流下的液体取部分上样进行SDSPAGE分析。 1.2.5 免疫兔子制备抗体血清 取200 g蛋白与弗氏完全佐剂按11比例混合后皮下注射初次免疫兔子, 以后每间隔2周, 取200 g蛋白与弗氏不完全佐剂按11比例混合加强免疫2次, 1周后兔耳缘静脉取血检测抗体效价并加强免疫1次, 如达到所需效价值7 d后取全血。 1.2.6 间接ELISA法检测抗体效价 以终浓度为1 g/L的HMGB1蛋白包被ELISA反应孔, 一抗是作为空白对照的PBS、 阴性对照的免疫前兔血清以及倍比稀释的抗HMGB1抗体, 二抗为HRP羊抗兔IgG(120 000), 最后加入底物显色后, 用酶标仪测定A450的值。结果以实验组值-空白对照/阴性对照-空白对照2.5为阳性, 以出现阳性反应的最高稀释度作为抗体的效价。 1.2.7 Western blot和免疫荧光染色检测抗体特异性 (1)Western blot: SDSPAGE电泳后将蛋白电转(4, 恒流300 mA, 2 h)到硝酸纤维素膜(NC)上, 然后将NC膜在含50 g/L脱脂奶粉的TBST中室温封闭2 h后, 加抗HMGB1抗体(1200)室温作用3 h, TBST洗去未结合一抗, 再加HRP羊抗兔IgG二抗(11 000)室温作用1 h, TBST洗去未结合二抗, 加底物反应3 min后暗室曝光并观察结果。(2)免疫荧光染色: 将细胞接种于14孔板中, 细胞密度为2 0004 000/孔, 37孵育过夜。24 h后加40 g/L多聚甲醛4作用30 min固定细胞, 再加入5 mL/L TritonX1004, 4透化处理20 min。然后加100 mL/L驴血清封闭1 h后, 加抗HMGB1抗体(150)4作用过夜。次日加FITC驴抗兔IgG二抗(1200)4作用1 h, 再加DAPI 4染色5 min, 最后加封片剂, 荧光显微镜下观察并拍照。 2 结果 2.1 PCR扩增的目的片段 经特异性引物进行PCR扩增后, 琼脂糖凝胶电泳可得到644 bp的目的条带(图1)。 2.2 验证原核表达质粒 重组质粒pRsetA2HMGB1经EcoR I和Xho I双酶切后出现644 bp的目的条带(图2), 说明重组质粒构建成功。图2 pRsetA2HMGB1原核表达质粒的酶切鉴定 2.3 鉴定诱导表达的HMGB1蛋白 将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3), 以IPTG诱导蛋白表达, 表达产物经SDSPAGE电泳后考马斯亮蓝染色在Mr约为30 000处可见一明显蛋白条带(图3)。且与预期蛋白大小相符, 由此确定HMGB1蛋白表达成功。 2.4 融合蛋白的纯化 融合蛋白经Ni2+NTA树脂亲和纯化后进行SDSPAGE, 结果显示目的蛋白得到了高度纯化, 纯度可达90%以上, 而且经标准蛋白BSA标化后浓度约为1 g/L(图4)。 2.5 抗体效价的检测 通过间接ELISA法进行检测后, 抗体效价可达到116 000, 而作为阴性对照的免疫前兔血清显色呈阴性。 2.6 抗体特异性的分析 (1)用纯化的HMGB1蛋白免疫兔子后得到兔抗人HMGB1抗体, Western blot分析显示此抗体可特异性与大肠杆菌经IPTG诱导所产生的HMGB1蛋白结合, 与菌体其他成分无交叉反应(图5A)。(2)HMGB1蛋白在多种肿瘤中都有表达, 收集肿瘤细胞系前列腺癌PCM2B4、 肺癌A549、 乳腺癌MDMBA231和MCF7、 结肠癌SW620、 宫颈癌HeLa、 白血病Jurkat细胞裂解物, 采用Western blot检测发现在Mr约为30 000处出现目的条带, 与文献报道的蛋白大小相符5, 表明此抗体可特异性识别内源性HMGB1蛋白 (图5B)。(3)在MDMBA231和A549细胞中, 免疫荧光染色显示HMGB1蛋白存在于细胞质中, 说明此抗体具有结合天然抗原的能力(图6)。 3 讨论 HMGB1蛋白是近几年发现的与肿瘤生长、 迁移、 侵袭密切相关的染色质蛋白, 而且相对正常组织来说, 它在多种肿瘤组织中是过表达的3。肿瘤细胞在侵袭转移期间HMGB1蛋白会与其配体晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)相互作用, 激活MAPK、 P38MAPK, JNK和P42/P44MAPK等信号通路, 继而引起基质金属蛋白酶MMP2和MMP9激活, 使细胞外基质降解促进肿瘤浸润和转移6。这表明如果人为阻断信号途径可能会抑制肿瘤的迁移, 而其中应用抗HMGB1抗体降低HMGB1水平是直接而有效的途径之一。最早应用抗HMGB1抗体是在炎症反应实验中, 实验发现抗HMGB1多克隆抗体可使LPS致死量攻击的小鼠生存率由0升至70%, 并且随着抗体剂量的加大, 最终可达100%7。同时抗HMGB1多克隆抗体也可明显减轻关节炎症状、 改善体重下降和关节组织的病理改变8。新近研究也显示, 应用抗HMGB1抗体进行干预后, 对严重内毒素血症、 脓毒症、 关节炎以及内毒素诱导的急性肺损伤均有积极的治疗作用。即使抗HMGB1抗体应用时机较晚, 仍可显著改善动物症状和预后9。这些研究为抗HMGB1抗体应用于炎症、 肿瘤等相关疾病治疗提供了实践基础, 使抗体治疗成为可能。 利用基因工程技术表达外源蛋白选择合适的表达载体是至关重要的。具有T7启动子的原核表达载体pRsetA2, 在未诱导前转录不启动, 蛋白不会泄漏表达, 不会影响宿主菌的生长。同时此载体N端带有6His, 即有利于纯化HMGB1融合蛋白, 又可增强免疫原性制备抗HMGB1抗体。本研究选用此载体成功构建了原核表达质粒pRsetA2HMGB1, 纯化HMGB1蛋白并制备了其抗体。经间接ELISA法检测该抗体效价可达116 000, Western blot和免疫荧光染色确定, 抗HMGB1抗体不仅可以和原核表达的HMGB1蛋白特异性结合, 而且也可与多种肿瘤细胞系中内源性的HMGB1蛋白特异性结合。这为更深入研究与HMGB1蛋白相关疾病创造了有利条件。【参考文献】 1 Muller S, Scafidi P, Degryse B, et al. The double life of HMGB1 chromatin protein: architectural factor and extracellular signalJ. EMBO, 2001, 20(16): 4337-4340.2 吴佳捷, 姚志韬. HMGB1的肿瘤生物学效应J. 中国普通外科杂志, 2007, 16(6): 584-586.3 Ellerman JE, Brown CK, de Vera Michael, et al. Masquerader: high mobility group Box1 and cancerJ. Clin Cancer Res, 2007, 13(10): 2836-2848. 4 张迎春, 刘 莹, 杨金菊, 等. Clusterin抗原的表达、 抗体制备及其初步鉴定J. 细胞与分子免疫学杂志, 2008, 24(1): 45-48.5 Jaakko Parkkinen, Erkki Raulo, Jussi Merenmies. Amphoterin, the 30kDa protein in a family of HM